Автореферат дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук.
Минск, 2004. 16 с.

Значение показателей иммунного статуса
в оценке эффективности
комбинированной терапии хронического гепатита С

Мицура В. М.
Гомельский гос. мед. универ.
Кафедра инфекционных болезней

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Хронический гепатит С (ХГС) — распространенное заболевание, для которого характерно, как правило, малосимптомное течение и отсутствие специфических клинико — биохимических признаков. При этом гистологические изменения в ткани печени могут прогрессировать, приводя к циррозу печени и первичной гепатокарциноме (Соринсон С.Н., 1998). Гепатит С — вирусная инфекция широко распространена в Республике Беларусь, причем количество хронических форм неуклонно возрастает (Карпов И.А., 2002).

В диагностике и лечении ХГС имеются несомненные достижения. Однако в этой области остается много нерешенных вопросов. Так, продолжают обсуждаться как диагностические методы, позволяющие надежно распознавать данное заболевание, так и подходы к его лечению (Жаворонок С.В. и др., 1998). Изучается роль иммунной системы в патогенезе ХГС для разработки новых, более эффективных способов лечения (Титов Л.П., 1999).

Центральную роль в элиминации вируса играет Т-клеточное звено иммунитета. Основными молекулами, координирующими действие иммунных клеток, являются цитокины, которые определяют эффективность иммунного ответа и течение воспалительного процесса в печени. Значение факторов гуморального и клеточного иммунитета, роль цитокинов в патогенезе хронического гепатита С изучено еще недостаточно (Маммаев С.Н., 2001).

В клинической практике на данном этапе наиболее эффективными при ХГС считаются препараты a-интерферона (a-ИФН), дающие до 25% случаев стойкой ремиссии (Ключарева А.А., 2000). Интерферонотерапия как разновидность иммунотерапии должна базироваться на адекватной оценке иммунного статуса. Исследование роли иммунной системы в процессе терапии a-ИФН имеет особое значение, так как показано, что неэффективность интерферонотерапии зачастую связана с иммунными нарушениями у больных ХГС (Никитин И.Г. и др., 1999; Макашова В.В. и др., 2002). В настоящее время, учитывая сложность, дороговизну, побочные эффекты и недостаточную результативность интерферонотерапии, остается актуальным поиск новых подходов к лечению ХГС. Использование иммуномодулирующей терапии, в том числе цитокинотерапии, в комплексном лечении больных ХГС приобретает большой научный и практический интерес (Цыркунов В.М. и др., 2002).

Настоящая работа посвящена комплексному изучению нарушений клеточного и гуморального иммунитета при интерферонотерапии хронического гепатита С и возможностям иммунокоррекции. Полученные результаты позволят определить роль параметров иммунной системы для эффективности интерферонотерапии и обосновать необходимость дополнительной иммунокоррекции с помощью препарата интерлейкина-2 (ИЛ-2).

Диссертация выполнена на базе кафедры инфекционных болезней Гомельского государственного медицинского института (зав. кафедрой — к.м.н., доцент Е.Л. Красавцев). Исследования выполнялись в Центральной научно-исследовательской лаборатории Гомельского ГМУ в рамках темы НИР «Исследование патогенетических механизмов соматических заболеваний инфекционной природы и разработка новых методов диагностики и лечения» (№ ГР 20031602 от 01.07.2003 г.), а также темы НИР «Разработать и организовать производство диагностических иммуноферментных наборов: конфирматорный тест HBsAg, ИФА набор для выявления HBsAg с чувствительностью 0,1 нг/мл и ИФА набор для определения спектра антител к вирусу гепатита С» в рамках ГНТП 02.06 «Инфекции и медицинские биотехнологии» (№ ГР 20032896 от 29.09.2003 г.).

Оптимизация терапии хронического гепатита С на основании комплексного изучения клеточного и гуморального иммунного ответа при лечении препаратами a-интерферона.

1. Изучить закономерности и клиническое значение циркуляции антител к отдельным структурным и неструктурным антигенам вируса гепатита С, а также аутоантител к структурам ткани щитовидной железы у больных хроническим гепатитом С, получающих интерферонотерапию.

2. Изучить закономерности и клиническое значение Т- и В- клеточного иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С в зависимости от получаемой интерферонотерапии.

3. Обосновать необходимость иммунокоррекции при терапии хронического гепатита С препаратами a-интерферона.

4. Оценить клиническую и иммунологическую эффективность комбинированной терапии препаратами a-интерферона и интерлейкина-2 у больных хроническим гепатитом С.

Объектом исследования были больные ХГС, проживающие в городе Гомеле и Гомельской области, получающие терапию препаратами a-интерферона либо комбинированную с интерлейкином-2 терапию.

Предмет исследования — комплекс клинико-лабораторных и иммунологических параметров у больных ХГС на фоне терапии препаратами a-интерферона и комбинированной терапии.

В работе использованы следующие методы:

1. Клинические: опрос, осмотр, пальпация, перкуссия, анализ историй болезни; общеклинический анализ крови с подсчетом формулы крови и гематологических показателей интоксикации: ЛИ, ЛИИ, ККП, ГПИ.

2. Биохимические: диагностика биохимических синдромов поражения печени (цитолиз, холестаз, гепатодепрессивный, мезенхимально-воспалительный).

3. Иммунологические:
а) показатели гуморального иммунитета:
-специфические: определение антител к HCV и его отдельным антигенам (анти-HCV общие и IgM, антитела к core-, NS3-, NS4-, NS5- белкам HCV);
-неспецифические: определение иммуноглобулинов классов IgG, IgA и IgM в сыв-ротке крови;
-аутоантитела к структурам щитовидной железы: тиреоглобулину (анти-ТГ) и тиреопероксидазе (анти-ТПО).
б) показатели клеточного иммунитета: определение абсолютного и относительного количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, их активной популяции, ТФР-Т-хелперов (Тх), ТФЧ-Т-супрессоров (Тс), соотношения Тх/Тс (иммунорегуляторный индекс, ИРИ), В-лимфоцитов, «нулевых» (ни Т, ни В) лимфоцитов, а также количественное определение цитокинов Тх1 (ИЛ-2 и ФНО-a) и Тх2 (ИЛ-4).
в) показатели макрофагального звена и функции фагоцитоза: фагоцитарный индекс и фагоцитарное число; количественное определение цитокина ИЛ-1b.

4. Инструментальные: ультразвуковая диагностика органов брюшной полости и забрюшинного пространства с проведением по показаниям пункционной биопсии печени под УЗИ — контролем, изучение патогистологического материала.

5. Статистические методы:
а) метод вариационной статистики Фишера-Стьюдента;
б) методы непараметрической статистики для проверки гипотезы о различии в независимых и зависимых группах: тест Манна-Уитни, парный тест Вилкоксона; критерий Краскела-Уоллиса для множественных сравнений;
в) точный критерий Фишера и критерий x² для оценки значимости различия частот наблюдений;
г) однофакторный корреляционный анализ с расчетом непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена rs и его уровней значимости p.

Впервые при комплексном исследовании показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных ХГС, получающих препараты a-ИФН, выявлено, что интерферонотерапия вызывает нарушения клеточного звена иммунитета (снижение Т-лимфоцитов и Т-хелперов, повышение «нулевых» лимфоцитов) с дисбалансом цитокиновой регуляции (повышение уровней Тх1-цитокинов ИЛ-2 и ФНО-a, Тх2-цитокина ИЛ-4, а также продуцируемого макрофагами ИЛ-1b).

На фоне интерферонотерапии развивается вторичный Т-клеточный иммунодефицит, причем риск его возникновения возрастает при увеличении дозы полученного интерферона и длительности интерферонотерапии.

Впервые предложена и патогенетически обоснована схема комбинированного применения препарата рекомбинантного ИЛ-2 (Ронколейкин^® ) в сочетании с препаратами a-ИФН для лечения больных ХГС, имеющих низкую биохимическую и гистологическую активность процесса, а также при наличии исходного иммунодефицитного состояния или его развитии на фоне интерферонотерапии. Использование этой схемы приводит к увеличению Т-лимфоцитов и их активной популяции, снижению общего IgM сыворотки, устранению дисбаланса цитокиновой регуляции со значимым снижением ИЛ-2 и ФНО-a и позволяет достичь полного ответа у 42,3% больных, частичного — у 23,1%.

Доказано формирование иммунодефицитного состояния (ИДС), требующего корре-ции, у больных ХГС и зависимость его от полученной дозы a-интерферона и длительности интерферонотерапии.

Обоснована целесообразность динамического иммунологического обследования больных ХГС, получающих интерферонотерапию, с помощью тестов I уровня в качестве скрининг-метода, что позволит своевременно диагностировать развитие вторичной иммунной недостаточности и провести ее коррекцию. Наиболее информативными тестами для оценки клеточного иммунитета являются содержание Т-лимфоцитов и Тх, ИРИ.

Антитела к NS5 белку HCV и анти-HCV IgM являются дополнительными маркерами вирусной репликации и активности процесса и могут использоваться в качестве прогностических факторов эффективности интерферонотерапии.

Из показателей системы иммунитета наиболее информативными для прогноза эффективности интерферонотерапии при ХГС являются уровень лейкоцитов, Т-лимфоцитов, Т-супрессоров, ИРИ, фагоцитарного индекса и уровни цитокинов ИЛ-4, ИЛ-1b и ФНО-a, а также HCV-специфических антител анти- NS5 и анти-HCV IgM.

Обоснована клинико-иммунологическая эффективность и целесообразность практического использования способа применения Ронколейкина^® совместно с препаратами a-интерферона для лечения ХГС. Инструкция по применению Ронколейкина^® для лечения ХГС утверждена Министерством здравоохранения Республики Беларусь.

1. У больных ХГС, не получающих лечения препаратами a-интерферона, имеет место снижение Т-хелперов, иммунорегуляторного индекса, в сыворотке крови больных по сравнению с донорами повышено содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1b и ФНО-a. У 18,7% больных имеется вторичная недостаточность клеточного звена иммунитета.

2. Интерферонотерапия у больных ХГС приводит к снижению количества Т-лимфоцитов и Т-хелперов, повышению «нулевых» лимфоцитов, а также дисбалансу цитокиновой регуляции с повышением уровней цитокинов ИЛ-1b, ФНО-a, ИЛ-4 и ИЛ-2. У 38,9% больных ХГС на фоне лечения препаратами интерферона возникает вторичная недостаточность клеточного звена иммунитета, причем вероятность ее развития возрастает при увеличении длительности интерферонотерапии и дозы полученного a-ИФН. У больных ХГС, получающих интерферонотерапию, частота выявления антитиреоидных антител (анти-ТГ и анти-ТПО) выше по сравнению с больными, получающими базисную терапию.

3. Отсутствие вирусологического ответа на терапию препаратами a-ИФН ассоциируется с преобладанием функции Тх2 над Тх1, что проявляется у не ответивших повышением цитокина ИЛ-4, снижением содержания Т-лимфоцитов и Тс, а также активацией гуморального иммунитета с повышением количества В-лимфоцитов и продукции ими как специфических антител (антитела к NS5 белку HCV и анти-HCV IgM), так и неспе-фических (повышение общего IgG сыворотки).

4. Комбинированная терапия ХГС препаратом ИЛ-2 (Ронколейкин^®) в сочетании с препаратами a-ИФН способствует активации Т-клеточного звена иммунитета, устранению дисбаланса цитокиновой регуляции со снижением повышенных уровней цитокинов и позволяет достичь полного ответа у 42,3% больных, частичного — у 23,1%.

Клинические обследования больных, забор крови на иммунологические исследования, определение методом иммуноферментного анализа антител к HCV (анти-HCV общие и IgM, антител к core-, NS3, NS4, NS5), содержания цитокинов (ИЛ-1b, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-a), антител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе; статистическая обработка результатов и написание всех разделов диссертации.

Материалы работы докладывались и обсуждались на республиканской научно-практической конференции «Эпидемиология, диагностика, патогенез, лечение и проф-лактика инфекционных заболеваний» (Гомель, 2001 г.); на VI Республиканской конференции студентов и аспирантов Беларуси (Витебск, 2001 г.); на научно-практической конференции, посвященной Дню медицинской науки (Гомель, 2002 г.); на Пятом международном симпозиуме гепатологов Беларуси (Гродно, 2002 г.); на областном обществе инфекционистов (Гомель, 2002, 2003); на врачебной конференции в Королевской больнице г. Абердин (Великобритания, 2003 г.); на V съезде инфекционистов Республики Беларусь (Минск, 2003).

По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 3 статьи в научных журналах, 13 статей в сборниках научных статей (из них 4 — за пределами Республики Беларусь) и 8 — в сборниках в виде тезисов (из них 5 — за пределами Республики Беларусь). Без соавторов написано 2 работы. Общее количество опубликованных страниц — 72.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, клинической характеристики исследуемой группы, трех глав результатов собственных исследований, заключения и выводов, указателя литературы, включающего 112 русскоязычных и 116 иностранных источников, приложения. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 39 таблицами и 7 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В течение 2000 — 2003 гг. на базе Гомельской областной инфекционной клинической больницы среди лиц, госпитализированных в отделение хронических вирусных гепатитов по клиническим показаниям с диагнозом «Хронический гепатит С» обследовано 112 пациентов.

Среди обследованных больных было 67 мужчин (59,8%) и 45 женщин (40,2%) в возрасте от 15 до 62 лет (средний возраст — 30,8±1,2 лет). По возрасту больные распределились следующим образом: до 20 лет — 24 чел. (21,4%), 21-35 лет — 54 (48,2%), 36-50 лет — 23 чел. (20,5%), более 50 лет — 11 чел. (9,8%).

Диагноз ХГС формулировался в соответствии с классификацией хронических гепатитов, рекомендованной Международным конгрессом гастроэнтерологов (Лос-Анджелес, 1994 г.) и подтверждался у всех больных обнаружением в сыворотке крови антител к HCV (анти-HCV суммарные) при отсутствии маркеров вирусных гепатитов А, В и D, а также ВИЧ. Диагноз у 76 больных был подтвержден обнаружением в сыворотке крови РНК HCV методом полимеразной цепной реакции. Генотип вируса определялся у 10 человек, при этом генотип 1а выявлялся у 1, 1b — у 6 больных, 2а — у 1, 3а — у 2 больных.

Стаж заболевания составил: менее 2 лет — 31 чел. (27,7%), от 2 до 5 лет — 39 чел. (34,8%), от 6 до 9 лет — 23 чел. (20,5%), 10 лет и более — 19 чел. (17,0%).

При выяснении эпидемиологического анамнеза были установлены вероятные пути заражения HCV. У 26 больных (23,2%) путь заражения предположительно связан с гемотрансфузиями, у 19 (17,0%) — с эпизодическим парентеральным введением наркотических препаратов, у 16 (14,3%) в анамнезе были инвазивные медицинские вмешательства, профессиональный контакт с кровью и ее препаратами имелся у 13 больных (11,6%), кадровыми донорами были 5 человек (4,5%), у 4 (3,6%) имелся тесный бытовой либо половой контакт с больными HCV-инфекцией, 3 человека (2,7%) имели татуировки. У оставшихся 26 больных (23,2%) путь заражения предположить не удалось.

Биохимическая активность ХГС на момент обследования в стационаре отсутствовала у 32 больных (28,6%), была минимальной (повышение АЛТ от 1 до 3 норм) у 42 (37,5%), умеренной (повышение АЛТ от 3 до 10 норм) — у 29 (25,9%), высокой (АЛТ свыше 10 норм) — у 9 человек (8,0%).

При морфологическом изучении 70 биоптатов печени определялись степень гистологической активности (индекс гистологической активности по Knodell либо гистологический индекс степени активности) и стадия фиброза (по гистологическому индексу стадии заболевания). Признаки гистологической активности отсутствовали у 1 больного (1,4%), соответствовали минимальной активности у 48 больных (68,6%), умеренной активности — у 21 (30,0%). Фиброз морфологически не определялся у 19 больных (27,1%), слабый фиброз печени (I стадия хронизации) выявлен у 34 (48,6%), умеренный фиброз (II стадия) — у 9 (12,9%), тяжелый фиброз (III стадия) — у 3 больных (4,3%), соответствовал циррозу печени (IV стадия) — у 5 больных (7,1%).

В зависимости от получаемой терапии больные были разделены на 3 группы:

При оценке показателей иммунограммы в качестве контроля использованы иммунограммы 26 клинически здоровых лиц (средний возраст — 34,4 2,6 лет), проживающих в г.Гомеле и Гомельской области, не имеющих маркеров инфицирования гепатотропными вирусами.

В качестве контроля при исследовании уровней цитокинов в сыворотках крови использовались 10 образцов сыворотки безвозмездных доноров, постоянно проживающих в Гомеле и Гомельской области и не имеющих хронических заболеваний и маркеров инфицирования вирусами парентеральных вирусных гепатитов.

Проведено сравнение структуры I группы (группа сравнения) со II и III группами по некоторым признакам (пол, возраст, уровни АЛТ) для решения вопроса о возможности их дальнейшего статистического анализа. Исследуемые группы были сопоставимыми по полу, возрасту и уровням АЛТ, что позволило провести статистический анализ данных групп.

В результате проделанной работы проведена характеристика показателей гуморального и клеточного иммунитета у больных ХГС, получающих терапию препаратами a-интерферона.

Закономерности и клиническое значение специфического и неспецифического гуморального иммунного ответа у больных ХГС при интерферонотерапии

Спектр антител к вирусу гепатита С (HCV) у больных ХГС при интерферонотерапии. У 98,8% больных хроническим гепатитом С выявлены антитела к NS3, антитела к core-белку и NS4 — по 97,6%, у 57,0% — антитела к NS5. У большинства обследованных больных ХГС (96,4%) одновременно выявлялись антитела к core, NS3 и NS4-белкам. В 1,2% антитела к белкам HCV не обнаруживались, несмотря на повторное выявление РНК вируса в крови методом ПЦР. Антитела анти-HCV IgM выявлены у 55,8% больных. При обнаружении анти-NS5 и анти-HCV IgM чаще выявлялся повышенный уровень АЛТ (р=0,024 и р=0,001 соответственно).

Значимые различия в частоте выявления анти-NS5 и анти-HCV IgM в зависимости от пола, возраста, времени от момента инфицирования отсутствовали (p>0,05). На фоне интерферонотерапии (II группа) анти-NS5 и анти-HCV IgM выявлялись у 41,7% больных, в I группе — 68,0% (р=0,018) и 66,0% (р=0,030) соответственно, что свидетельствует о подавлении вирусной репликации и активности ХГС при лечении препаратами a-ИФН. Антитела к NS5 и анти-HCV IgM могут считаться дополнительными маркерами вирусной репликации и активности процесса при интерферонотерапии ХГС.

Вирусологический ответ на 3-месячный курс интерферонотерапии значимо чаще ассоциировался с отсутствием анти-HCV IgM (68,7%, р=0,021) и анти-NS5 (75,0%, р=0,036). Антитела к NS5 и анти-HCV IgM могут использоваться и в качестве прогностических факторов эффективности интерферонотерапии.

Антитела к тиреоглобулину и тиреопероксидазе у больных ХГС при интерфе-ронотерапии. Антитела к структурам щитовидной железы, как маркер аутоиммунизации, присутствовали у 25,0% больных ХГС. У 21,4% больных ХГС выявлены антитела к тиреоглобулину, у 8,0% — антитела к тиреопероксидазе, у 4,5% — анти-ТГ и анти-ТПО выявлялись совместно. Чаще антитела выявлялись у лиц старше 40 лет, причем различие для анти-ТПО оказалось статистически достоверным (p=0,042). При наличии фиброза печени III-IV стадии частота выявления анти-ТГ и анти-ТПО составила 38,9% и 22,2%, что значимо выше, чем при фиброзе 0-II степени (18,1%, р=0,049 и 5,3%, р=0,016 соответственно). У больных, инфицированных 6 лет назад и более, частота выявления анти-ТГ составила 26,2%, анти-ТПО — 16,7%, у больных, со временем от момента инфицирования не более 5 лет — 18,6% (р>0,05) и 2,9% (р=0,009) соответственно. С увеличением длительности заболевания и стадии ХГС увеличивается продукция антитиреоидных антител, причем анти-ТПО является более чувствительным маркером, чем анти-ТГ.

Закономерности и клиническое значение клеточного иммунного ответа у больных ХГС, получающих интерферонотерапию

В сыворотке крови больных ХГС по сравнению с донорами наблюдалось значимое повышение уровней цитокинов ИЛ-1b (р=0,0001) и ФНО-a (р=0,006), что отражает повышенную активацию макрофагов и способствует поддержанию воспалительного процесса в печени больных ХГС. Уровни цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-1b и ФНО-a) нарастали по мере усугубления нарушений клеточного иммунитета, повышаясь при наличии диагностированного вторичного ИДС (значимо для ИЛ-4, р=0,004 и ИЛ-1b, р=0,025).

На фоне лечения ИФН выявлено значимое снижение относительного количества Т-лимфоцитов (p=0,001) по сравнению с контрольной группой. Абсолютный и относительный уровни Т-хелперов также был значимо сниженным (p=0,003 и р=0,011 соответственно), а уровень «нулевых» лимфоцитов — значительно повышенным (p=0,009) на фоне лечения a-ИФН по сравнению с контрольной группой. В 50% случаев на фоне интерферонотерапии имелось снижение иммунорегуляторного индекса, обусловленное снижением Т-хелперов, однако в 19,4% случаев регистрируется повышение ИРИ, связанное со значительным снижением Т-супрессоров, что может отражать развитие аутоиммунных нарушений под действием a-ИФН.

У 38,9% больных ХГС на фоне интерферонотерапии диагностирована вторичная недостаточность клеточного звена иммунитета, у 55,6% — «группа риска развития ИДС», у больных ХГС, получающих патогенетическую и симптоматическую терапию — 18,7% и 71,9% соответственно.

При лечении препаратами a-ИФН вторичный иммунодефицит возникает или усугубляется на фоне терапии. Установлено, что риск развития вторичного иммунодефицитного состояния увеличивается при увеличении длительности интерферонотерапии (р=0,021) и дозы полученного ИФН (р=0,009).

В сыворотке крови больных ХГС по сравнению с донорами наблюдалось повышение уровней цитокинов ИЛ-4, ИЛ-1b, ФНО-a, ИЛ-2, усугублявшееся на фоне интерферонотерапии. Концентрации цитокинов в сыворотках больных I и II групп сравнивались с показателями доноров с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Средняя концентрация ИЛ-4 у доноров составляла 21,95 пг/мл, в I группе — 79,83 (р=0,58), во II группе — 147,02 (р=0,047). Средняя концентрация ИЛ-1b — 4,43 пг/мл у доноров, в I группе 376,13 (p=0,0001), во II группе — 553,04 (p=0,0001). Средняя концентрация ФНО-a у доноров — 24,04 пг/мл, в I группе 128,33 (p=0,006), во II группе 190,92 (p=0,005). Средняя концентрация ИЛ-2 у доноров — 20,86 пг/мл, в I группе — 49,24 пг/мл (р=0,26), во II группе — 77,52 (р=0,031).

Повышение уровня ИЛ-2 при интерферонотерапии может быть связано со способностью препаратов a-ИФН кратковременно повышать уровень ИЛ-2 в сыворотке крови, или с развитием аутоиммунных реакций на фоне лечения. Избыточное содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-1b и ФНО-a) у больных ХГС и его усугубление под действием a-ИФН отражает повышенную активацию макрофагов и способствует поддержанию воспалительного процесса в печени больных ХГС. Уровень ИЛ-4 у больных ХГС повышен по сравнению с группой доноров (значимо повышен на фоне интерферонотерапии, р=0,047), что характеризует иммунный ответ при ХГС преимущественно по Тх2-типу. В ряде случаев (у 16,7% больных I группы и у 35,0% больных II группы) повышение уровней ИЛ-4 (Тх2-цитокин) сочеталось с повышением уровней ИЛ-2 (Тх1-цитокин), что является косвенным признаком иммунодефицита. Таким образом, косвенные признаки иммунодефицита выявлялись при ХГС чаще на фоне терапии a-ИФН, чем при патогенетической и симптоматической терапии.

Уровни всех исследуемых цитокинов были значительно выше среди больных с наличием антитиреоидных антител (р<0,05), что свидетельствует о важной роли аутоиммунных реакций в патогенезе ХГС. Уровни ИЛ-2 и провоспалительных цитокинов (ИЛ-1b и ФНО-a) могут повышаться при аутоиммунной патологии. Повышение уровней ИЛ-4 говорит об активации Тх2 у больных ХГС, имеющих антитиреоидные антитела, что способствует персистенции вируса. Повышение уровней цитокинов может быть обусловлено в ряде случаев аутоиммунными нарушениями у больных ХГС.

Не установлено связи между репликацией вируса (оцениваемой по наличию анти-HCV IgM) и уровнями цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-1b, ФНО-a) в сыворотке крови больных ХГС. Сывороточные уровни исследованных цитокинов не коррелируют со значениями АЛТ, т.е. не отражают выраженность цитолиза гепатоцитов.

Оценивался вирусологический ответ после 3-месячного курса терапии a-ИФН. Для ответивших на терапию a-ИФН характерно повышение уровней лейкоцитоза при более низком относительном лимфоцитозе (p<0,05), значимое повышение Т-лимфоцитов (р=0,037) и Т-супрессоров (p=0,006) по сравнению с не ответившими. В то же время в группе не ответивших впоследствии на терапию a-ИФН были выше уровень В-лимфоцитов (р=0,044) и фагоцитарного индекса (р=0,007). Низкие уровни лейкоцитоза, относительного содержания Т-лимфоцитов и Т-супрессоров могут являться прогностическими признаками отсутствия ответа на терапию. Некоторое повышение уровня В-лимфоцитов может отражать преимущественную активацию Тх2-цитокинов в группе не ответивших на терапию.

Активация функции макрофагов с повышением показателей фагоцитоза (значимым для фагоцитарного индекса, p<0,05) и гиперпродукцией провоспалительных цитокинов ИЛ-1b и ФНО-a является неблагоприятным прогностическим признаком ответа на лечение. Повышенные уровни ИЛ-4 также способствуют неэффективности интерферонотерапии, отражая повышение продукции Тх2-цитокинов.

Уровни лейкоцитоза, относительного лимфоцитоза, Т-лимфоцитов и Т-супрессоров, а также уровни цитокинов ИЛ-4, ИЛ-1b и ФНО-a могут быть использованы для ориентировочного прогнозирования ответа на интерферонотерапию.

Терапия препаратами a-ИФН способствует усугублению имеющегося дисбаланса клеточного иммунитета и цитокиновой регуляции. Данные нарушения способствуют персистенции вируса и прогрессированию заболевания, а также неэффективности интерферонотерапии. Это требует динамического наблюдения за иммунным статусом больных ХГС перед назначением препаратов ИФН и в процессе терапии.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что лекарственные препараты, способные устранять иммунные нарушения, снижать продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами, а также активировать Тх1, могут повысить эффективность терапии препаратами a-ИФН.

Клиническая и иммунологическая эффективность применения препарата ИЛ-2 совместно с препаратами альфа-интерферона в комплексной терапии ХГС

Установлена хорошая переносимость терапии Ронколейкином^®, побочные эффекты в виде кратковременного гриппоподобного синдрома зарегистрированы у 38,5% больных после применения препарата, в 30,8% случаев больные отмечали улучшение самочувствия на фоне лечения.

У 87,5% больных после применения Ронколейкина^® отмечена положительная динамика параметров клеточного звена иммунитета. После применения Ронколейкина^® у больных ХГС значимо возросло относительное количество Т-лимфоцитов (р=0,032), их активной популяции (р=0,002), а также значимо снизился уровень иммуноглобулинов класса IgM (р=0,038). Снижение количества В-лимфоцитов и иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA (значимо для IgM) свидетельствует о сдвиге соотношения Тх1/Тх2 в сторону Тх1, стимулирующих преимущественно клеточное звено иммунитета. У препарата Ронколейкин^® имеется иммуномодулирующая активность, его применение на фоне интерферонотерапии приводит к пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов.

Применение Ронколейкина^® на фоне интерферонотерапии способствует устранению дисбаланса цитокиновой регуляции со снижением повышенных уровней всех исследуемых цитокинов, при этом снижение уровней ФНО-a и ИЛ-2 по сравнению со II группой было статистически значимым (p=0,026 и р=0,032 соответственно).

Ни у одного из 21 больного III группы (0%) не было отмечено одновременного повышения уровней ИЛ-4 (Тх2-цитокин) и ИЛ-2 (Тх1-цитокин), что косвенно свидетельствует о ликвидации иммунной недостаточности после применения Рронколейкина^®. При сравнении данного показателя с аналогичными показателями в I и II группах (16,6% и 35,0% соответственно) с помощью точного критерия Фишера выявлено значимое его снижение в III группе (рI-III=0,048; pII-III=0,003).

В результате комбинированного лечения с Ронколейкином^® полный ответ зарегистрирован у 42,3% больных, частичный — у 23,1%, во II группе у больных, получавших монотерапию a-ИФН — 22,2% и 25,0% соответственно.

Ронколейкин^® может применяться совместно с препаратами ИФН у больных ХГС с минимальной биохимической активностью либо ее отсутствием, а также при наличии иммунодефицита до терапии a-ИФН или в ее процессе.

Необходимы дальнейшие исследования клинической эффективности комбинирован-ной терапии ХГС препаратами a-ИФН и ИЛ-2 (Рронколейкин^®) в соответствии с принципами доказательной медицины (evidence based medicine) для более точного определения показаний к терапии, оптимизации доз препаратов и длительности лечения.

ВЫВОДЫ

1. У больных ХГС, не получающих препараты a-интерферона либо комбинированного лечения, наблюдаются нарушения клеточного звена иммунитета (снижение ТФР-Т-хелперов, р=0,04, и иммунорегуляторного индекса, р=0,04), у 18,7% больных диагностируется вторичная недостаточность клеточного звена иммунитета. В сыворотке крови больных ХГС по сравнению с донорами выявляется повышение содержания провоспалительных цитокинов ИЛ-1b (р=0,0001) и ФНО-a (р=0,006). Значения АЛТ, как маркера синдрома цитолиза, не коррелируют с продукцией аутоантител, а также уровнями ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-1b, ФНО-a [5, 10, 12].

2. Интерферонотерапия у больных ХГС приводит к снижению уровней Т-лимфоцитов (р=0,001) и ТФР-Т-хелперов (р=0,003), повышению «нулевых» (ни Т, ни В) лимфоцитов (р=0,009). У 38,9% больных ХГС на фоне лечения препаратами интерферона формируется вторичная недостаточность клеточного звена иммунитета, вероятность ее развития возрастает при увеличении длительности интерферонотерапии и дозы полученного a-ИФН (p<0,05). Терапия препаратами a-ИФН приводит к дисбалансу цитокиновой регуляции с повышением сывороточных уровней ИЛ-2, ИЛ 4, ИЛ-1b, ФНО-a, превосходящих уровни данных цитокинов у доноров (p<0,05). Уровни ИЛ-4 и ИЛ-1b нарастают по мере усугубления нарушений клеточного иммунитета (р=0,004 и р=0,025 соответственно). Частота выявления аутоантител к тиреоглобулину у больных на фоне интерферонотерапии составляет 35,5%, к ТПО - 16,1%, у больных, получающих базисную терапию, - соответственно 16,0% (р=0,025) и 4,9% (р=0,049) [5, 10, 12, 14, 22].

3. Отсутствие вирусологического ответа на терапию препаратами a-ИФН ассоциируется с преобладанием функции Тх2 над Тх1, что проявляется у не ответивших повышением цитокина ИЛ-4 (р=0,023), снижением содержания Т-лимфоцитов (р=0,037) и ТФЧ-Т-супрессоров (р=0,006), а также активацией гуморального иммунитета с повышением количества В-лимфоцитов (р=0,044) и продукции ими как специфических антител (антитела к NS5 белку HCV и анти-HCV IgM), так и неспецифических (повышение общего IgG сыворотки). До назначения интерферонотерапии анти- NS5 выявлены у 25,0% ответивших и у 60,0% не ответивших на 3-месячный курс интерферонотерапии (р=0,036), анти-HCV IgM — у 31,3% и 70,0% соответственно (р=0,021). Повышение функций фагоцитов с повышением фагоцитарного индекса (р=0,007) и гиперпродук-цией провоспалительных цитокинов ИЛ-1b (р=0,011) и ФНО-? (р=0,031) также характерно для не ответивших на терапию [5, 10, 11, 12, 13, 15].

4. Комбинированная терапия препаратами a-интерферона в сочетании с рекомбинантным ИЛ-2 (Рронколейкин^®) способствует активации Т-клеточного звена иммунитета: увеличению Т-лимфоцитов (р=0,032) и их активной популяции (р=0,002), снижению IgM сыворотки крови (р=0,038), а также позволяет устранить дисбаланс цитокиновой регуляции, снижая повышенные уровни ФНО-a (р=0,032) и ИЛ-2 (p=0,026). К завершению курса терапии Ронколейкином^® и a-интерфероном полный ответ зарегистрирован у 42,3% больных, частичный — у 23,1% [9, 10, 16, 23].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ