Материалы V Международного симпозиума «Повреждения мозга». Санкт-Петербург, ВМА,1999. С. 440 — 449.

Применение цитокиновой иммунотерапии
в комбинированном лечении внутримозговых опухолей головного мозга

Свадовский А. И.
Клиника «Нейроэскулап», Москва

Реферат

В работе анализируется опыт использования цитокиновой иммунотерапии с применением отечественного дрожжевого рекомбинантного интерлейкина -2 (рИЛ-2) и комбинации лимфокин-активированных ЛАК + рИЛ-2 у больных с внутримозговыми опухолями головного мозга. Диагностически лабораторный комплекс включал в себя компьютерную и магнитно-резонансную томографию, проточную лазерную цитофлоуриметрию и моноклональные антитела для оп-ределения количества лимфоцитов и других иммунных параметров в венозной крови, световую и электронную микроскопию, типирование лимфоцитов в биоптатах, радиоизотопную гамма энцефалографию, ЭЭГ-мониторинг. Оцениваются показания, результаты диагностическо-лабораторных исследований и лечения.

Лечение внутримозговых опухолей головного мозга (ВОГМ) традиционно привлекает к себе внимание нейрохирургов и смежных специалистов, поскольку результаты даже активной комбинированной терапии остаются в большинстве случаев неудовлетворительными (1, 6).

На сегодняшний день очевидно, что открытое нейрохирургическое вмешательство и/или химио-лучевая терапия имеют свои естественные ограничения, связанные с невозможностью абсолютно радикального хирургического удаления опухоли, низкой чувствительностью (или нечувствительностью) мно-гих ВОГМ к химио-лучевой терапии и осложнениями от ее применения (2, 3). Быстрый прогресс биотехнологической науки и иммунологии в последнее десятилетие, позволил применить эти передовые достижения в нейрохирургической практике (4, 9). Данные методы терапии ВОГМ основаны на использовании ак-тивированных in vitro лимфоцитов в сопровождении генно-инженерных полипептидов (цитокинов).

Однако по данным литературы большинство исследований касается экспериментальных работ, и лишь небольшую часть составляют клинические сообщения (5, 7, 8). Выполненные ранее исследования проведены без сложного лабораторно-диагностического комплекса, не анализировалась взаимосвязь данных, полученных при различных методах обследования, количество больных, как правило, было незначительным. Также не учитывались взаимовлияние эффекторов клеточного звена иммунитета и проблемы проницаемости ГЭБ. Цитокиновая иммунотерапия применялась как «средство отчаяния» и практически только при одном виде ВОГМ — глиобластомах. Использовалась исключительно ЛАК+рИЛ-2 терапия в виде локального орошения ложа удаленной опухоли в послеоперационном периоде.

На основании всего вышеизложенного можно сделать вывод, что комплексное изучение проблемы цитокиновой иммунотерапии ВОГМ и некоторых других неоплазий в контексте ее связи с ГЭБ, представляет собой не только практический (клинический) интерес, но и важное теоретическое значение, расширяющее наши представления о нормальной и патологической физиологии головного мозга.

Материал и методы

Катамнез прослежен у вышеприведенной выделенной нами группы больных до 3,4 лет от момента завершения комбинированной терапии.

В настоящей работе использовался рекомбинантный дрожжевой интерлейкин -2 человека (ООО «Биотех», С.-Петербург). Применяли его в виде длительных внутривенных инфузий на 0,9% физиологическом растворе (400,0 мл) в течение 4-8 часов. Суммарная курсовая доза рИЛ-2 достигала максимально 40 млн МЕ, минимальная — 10 млн МЕ, минимальная суточная доза — 1 млн МЕ. Рекомбинантный интерферон-a2b («Schering-Plough», USA & «Sandoz», Switzerland) вводили внутримышечно в суммарной курсовой дозе до 50-60 млн МЕ; после ЛАК-терапии в сопровождении рИЛ-2 применяли g-интерферон (IFN-g) отечественной разработки в суммарной дозе 5 млн МЕ в виде подкожных инъекций.

У всех больных изучались показатели клеточного иммунитета в периферической венозной крови при поступлении и в динамике — после операции, до и после проведения иммунотерапии. Всего у 50 больных выполнено 126 исследований на современном методологическом уровне с применением моноклональных антител к лимфоцитарным маркерам CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, CD72 и проточной лазерной цитофлуориметрии («Becton Diskinson», USA), в некоторых наблюдениях исследовали также продукцию TNF-a, ИЛ-1, спонтанную и индуцированную РБТЛ и некоторые другие параметры.

Получение лимфокин-активированных киллерных (ЛАК) клеток проводили по методике L.M.Muul et al (1986) в авторской модификации, не раскрываемой в данной работе по причине патентования.

Жизнеспособность полученных ЛАК-клеток варьировала в диапазоне 97-99%. ЛАК-клетки вводили пациентам в концентрации 5-10 млн клеток/мл в растворе рекомбинантного ИЛ-2 (4 тыс. МЕ/мл физиологического раствора) в объеме 500 мл/сутки со скоростью инфузии 4-6 капель/мин.

КТ выполняли всем больным по мере клинической необходимости (всего сделано 71 исследование). Использовали рентгеновский компьютерный томограф «Somatom» («Siemens», Германия) с матрицей 256х256. Под перитуморальным отеком (ПТО) на КТ понимали зону пониженной плотности (+18 — +25H), окружающую глиомы.

МРТ выполнена 34 больным, из них 25 больным I группы, 7 больным II группы и 2 больным III группы. Исследования проводились на различных аппаратах с напряженностью магнитного поля от 0,5 до 1,5 Т («Brucker», «Siemens») в Т1 и Т2 режимах. Изучалась клиническая эффективность полученных изображений ПТО в указанных двух режимах. Под ПТО на МРТ понимали сигнал повышенной активности (СПА), окружающий новообразования в режиме Т2.

Также, на КТ и на МРТ оценивали взаимосвязь ПТО и желудочковой системы до и после хирургического вмешательства.

Количественную оценку проницаемости ГЭБ определяли по альбумину и иммуноглобулину G (IgG), используя соотношение альбумин ликвора (мг/л) / альбумин сыворотки (г/л), предложенное K.Felgenhauer (1974) (коэффициент Фельгенхауэра — КФ или QAlb), а также аналогичное соотношение для IgG. Забор периферической крови и ликвора производили натощак с интервалом не более 30 мин. Всего проведено 66 исследований КФ по альбумину и IgG у 36 больных с ВОГМ. За норму принимали КФ равный 0-8. Исследовали взаимосвязь данных показателей и результатов других параклинических методов, включая КТ и МРТ, а также динамические изменения КФ до и после цитокиновой иммунотерапии с использованием рИЛ-2. Концентрацию альбумина в ликворе и сыворотке крови определяли на лазерном нефелометре BLN («Behring Werke», Германия).

Радионуклидную гаммаэнцефалографию (РГЭГ) проводили на гаммакамере «Toshiba» GCA-202 (Япония) в стандартных позициях через 1 час после внутривенного введения (а в отдельных наблюдениях — через 2-3 часа) радио-фармпрепарата (РФП). Использовали 99mTc-технемек отечественного производства. Всем больным внутривенно вводили 375-555 мбк. Всего проведено 94 исследования у 39 больных, но не менее 1-2 раз каждому больному. Исследования проводили больным в динамике до и после иммунотерапии и хирургического лечения. Учитывая слабое накопление РФП некоторыми видами ВОГМ головного мозга, у 23 больных проводили обработку полученных данных при помощи специальных программных фильтров: Метца, Батерворта и др., что способствовало выявлению и уточнению границ опухолей. Полученные результаты обрабатывали на персональном компьютере PC AT386 с применением системы обработки данных «GoldRada» (Россия).

Прицельную оценку опухолевых биоптатов в динамике до и после ЦИ провели по данным световой микроскопии у 12 больных с ВОГМ. При этом всего было выполнено 35 исследований. Во всех других наблюдениях, когда получали биопсийный материал, проведено плановое стандартное патоморфологическое исследование.

Электронную микроскопию биоптатов опухолей провели у 14 больных в динамике (всего выполнено 23 исследования). Использовали электронный микроскоп «Toshiba» (Япония). Особое внимание уделяли состоянию так называемых «плотных контактов» в ультраструктуре капилляров опухолевой ткани, наличию и состоянию находящихся в поле зрения лимфоцитов в динамике после цитокиновой терапии, их предполагаемому взаимодействию с опухолевыми клетками.

Для количественного изучения «забрасываемых» в опухолевую ткань после цитокиновой иммунотерапии субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD25+,CD72+) использовали метод непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител к кластерам дифференцировки вышеприведенных лимфоцитов. Всего данный метод применен у 7 больных (4 больных с рИЛ-2 и 3 больных с ЛАК +рИЛ-2 иммунотерапией).

Приготовленные на основании данного метода из опухолей этих больных клеточные суспензии в виде мазков еще раз просматривали цитологически при световой микроскопии на предмет выявления лимфоцитарно-опухолевого взаимодействия.

Методом картирования ЭЭГ и 3-х мерной локализации нами обследовано 21 больной до и после лечения рИЛ-2. Общее число обследований составило 42. Изучение функциональной активности головного мозга до и после цитокиновой иммунотерапии выполнялось как у тех больных, где ЦИ проводилась до открытого нейрохирургического вмешательства (4 больных), так и после тотального/субтотального удаления опухоли или ее биопсии (17 больных).

Для анализа и дальнейшей обработки данных проводилась 16-канальная регистрация ЭЭГ (фирмы ALVAR, Франция) в фоне и при нагрузках (ритмическая фотостимуляция и 3-х минутная гипервентиляция). Электроды располагались по схеме «10-20», использовались монополярные и биполярные отведения с одновременной записью 3-4 безартефактных отрезков по 30 сек. в виде файлов в память компьютера. Для получения количественных данных ЭЭГ и для построения карт пространственного распределения скальповых потенциалов использовалась программа «Нейрокартограф» и оценка 16-канальной записи по мощности. Вышеуказанная программа обеспечивала построение карт средних мощностей для шести основных типов биоэлектрической активности, получение количественных данных по мощности, средней частоте, максимальной мощности и соответствующей ей частоте по каждому из 16 каналов.

Изучались следующие количественные показатели: оценка общемозговых изменений по интегральному индексу ЭЭГ дельта+тета/альфа+бета в интактном полушарии до и после цитокиновой терапии, интенсивность очага по соотношению максимальной амплитуды дельта волны к ее частоте в зоне с максимальной выраженностью дельта волн до и после цитокиновой иммунотерапии. Используемая система «Brainloc» (Коптелов Ю.М., Гнездицкий В.В.,1989) позволяет проводить 3-х мерную локализацию источников электрической активности мозга на основании потенциальных карт, при этом применяли метод дипольной локализации.

В ходе работы также проводилась обработка исходной ЭЭГ по мощности. Далее по спектральной карте выбирался частотный диапазон, в котором расположен максимум дельтаактивности, т.к. при опухолях головного мозга характерно усиление именно этого вида биоэлектрической активности. В выбранном диапазоне проводилась фильтрация исходной кривой.

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере IBM PC AT 486, используя программу «Statgraphic», обеспечивающую обсчет результатов методами вариационной статистики.

Результаты и их обсуждение

Выявлена возможность клиренса отечной жидкости при ПТО в унилатеральную часть желудочковой системы, носящего компенсаторный, метаболический, характер и являющегося способом естественной регулировки и компенсации ВЧГ. Очевидно, что этот механизм разрешения отека носит универсальный характер и встречается, как уже было показано, и при очаговой ЧМТ. В условиях, когда ЦИ всегда приводит к появлению или усилению ПТО, очевидно, что усиливающийся клиренс отечной жидкости, очевидно, будет происходить через желудочковую систему.

Анализ проницаемости ГЭБ по альбумину выявил нормальные значения фоновых показателей QAlb, которые не изменялись даже под воздействием цитокиновой иммунотерапии (рИЛ-2) (Табл. 4, 5, 6). Таким образом, применение ЦИ не приводило к выходу с отечной перитуморальной жидкостью альбумина, что могло бы привести к изменению градиента онкотического давления от опухолевого микроциркуляторного сосудистого русла в сторону здоровой мозговой ткани. Мы назвали такую отечную жидкость «рафинированной», т.е. фактически обедненной белками.

P-достоверность отличий между показателями до и после лечения.

Под воздействием проводимой ЦИ выявлен исходный или динамический синтез IgG, что может указывать на интертекальное его происхождение, нося-щее, очевидно, защитный заместительный характер.

Динамическое применение РГЭГ до и после ЦИ с использованием рИЛ-2, а также комбинация ЛАК+рИЛ-2 выявило значительное повышение проницаемости ГЭБ в самой ткани опухоли или ее остатках и по периметру ложа удаленной внутримозговой опухоли. Это проявлялось в появлении (усилении) накопления РФП в вышеприведенных структурах в виде шаровидного образования и кольца (полукольца). Мы считаем, что зона повышения проницаемости ГЭБ, видимая на РГЭГ в виде кольца (полукольца) после тотального/субтотального удаления опухоли, представляет собой перифокальный очаг цитокин-индуцированного воспаления. Согласно нашим данным он возникает не спонтанно, а индуцированно под воздействием проводимой ЦИ. Воспаление очевидно связано со способностью активированных лимфоцитов пенетрировать эндотелий капилляров опухолевых сосудов.

Развитие данного воспаления, по нашему мнению, обеспечивает уничтожение остатков опухолевой ткани и опухолевых клеток, всегда остающихся после хирургии.

Световая микроскопия (СМ) выявила способность иммунокомпетентных клеток проникать как периваскулярно, так и диффузно в паренхиму опухолевой ткани, независимо от гистогенеза новообразования. При динамическом исследовании биоптатов показано, что подобная лимфоцитарная инфильтрация свидетельствует об "иммунной атаке" и вызывает свежие очаги некроза в опухоли. Т.о., мы считаем, что между степенью лимфоцитарной инфильтрации опухолевой ткани и наличием в ней очагов некроза после проведенной ЦИ существует непосредственная прямая связь, возникающая вследствие взаимодействия лимфоцитов, обладающих киллерными свойствами, и опухолевой клетки. В пользу лимфоцит-индуцированного некроза опухолевой ткани свидетельствует и отсутствие какого-либо повреждения здоровой мозговой ткани на границе с опухолевой, видимое при исследовании биоптатов. В целом же, при СМ, постцитокиновые биоптаты имели строение напоминающее губку.

Также, согласно данным электронной микроскопии, установлен факт так называемой активации лимфоцитов, способных преодолевать эндотелий микрососудистого русла, проникать в опухолевую ткань и вступать в тесный контакт с опухолевыми клетками. Были выявлены признаки тесного взаимодействия лимфоцита и опухолевой ткани, цитолиза опухолевой ткани и присутствие в ней плазматических клеток, что является свидетельством развертывания антителобразования.

P-достоверность отличий между показателями до и после лечения.

P1 — уровень достоверности отличий между группами различных глиом (по степени злокачественности).

P1 — уровень достоверности отличий между группами различных глиом (по степени злокачественности).
Р2 — уровень достоверности отличий между аналогичными показателями у больных группы I-А и группы Б.

P1 — уровень достоверности отличия между значениями до и после терапии с рИЛ-2.

Выводы

1. Проводимая с использованием рИЛ-2 или комбинация ЛАК+рИЛ-2 цитокиновая иммунотерапия обеспечивает быстрый рост числа основных иммунокомпетентных клеток и устраняет имеющийся в периферической крови иммунодефицит клеточного звена. ЛАК+рИЛ-2 терапия, по сравнению с рИЛ-2-терапией, является значительно более мощным индуктором иммунной системы и обеспечивает нормализацию показателей клеточного звена иммунитета, начиная с 3-х суток от начала лечения. Получили свое клиническое подтверждение многочисленные экспериментальные исследования интерлейкина-2 как ростового фактора для основных субпопуляций Т-лимфоцитов. Кроме того, цитокиновая иммунотерапия стимулирует эндогенную продукцию других цитокинов (ФНО-*, ИЛ-1 и др.), также участвующих в противоопухолевом ответе иммунной системы. Установлена низкая токсичность и отсутствие серьезных побочных эффектов при использовании отечественного рекомбинантного интерлейкина -2, что делает его пригодным для экстракорпорального стимулирования культуры лимфоцитов в процессе получения ЛАК-клеток (ЛАК-терапия) и сугубо медикаментозного применения в виде раствора для внутривенных инфузий. Патогенетической основой для проведения цитокиновой иммунотерапии больным с ВОГМ головного мозга является снижение показателей клеточного иммунитета в периферической крови, исходно низкая степень лимфоцитарной инфильтрации опухолевой ткани, способность активированных лимфоцитов и, очевидно, других цитокинов, проникать сквозь ГТБ и лизировать опухолевые клетки.

2. Изучение ПТО по данным КТ-МРТ в динамике выявило, что клиренс отечной жидкости направлен в прилежащую часть желудочковой системы и субарахноидальное пространство. В зависимости от хирургического радикализма может произойти полное прекращение клиренса отечной жидкости или же клиренс может продолжаться неопределенно долго. При ЦИ, усиливающей ПТО, возрастающий клиренс отечной жидкости, по всей видимости, также происходит через унилатеральную желудочковую систему и субарахнодальное пространство.

3. Анализ данных коэффициента проницаемости ГТБ по альбумину при базовом исследовании и после проведенной цитокиновой иммунотерапии показывает его стабильные значения, без массивного выхода белка в мозг и далее в ликвор. Мы полагаем, что отечную жидкость с низким содержанием белка, формирующую ПТО, можно назвать «рафинированной плазмой», которая не может создать быстро прогрессирующий онкотический градиент и, тем самым, привести к усилению ПТО.

4. Показана способность ЦИ усиливать проницаемость ГЭБ по данным радионуклидной энцефалографии только непосредственно в паренхиме внутримозговой опухоли и никогда — в интактном мозге. После тотального/субтотального хирургического удаления опухоли цитокиновая иммунотерапия создает в ложе удаленного субстрата очаг цитокин-индуцированного воспаления, косвенно отображаемого при исследовании в гамма-камере в виде кольца/полукольца накопления РФП. Эти результаты создают предпосылки для профилактического (адьювантного) использования ЦИ после радикального хирургического вмешательства, направленного на борьбу с оставшимися опухолевыми клетками вокруг ложа удаленной опухоли.

5. Подтверждена способность активированных под воздействием цитокиновой иммунотерапии некоторых субпопуляций лимфоцитов (в основном, CD8+, CD16+, CD25+) проникать через ГТБ и лизировать опухолевые клетки глиом in vivo как у больных с низкой, так и с высокой степенью анаплазии, о чем свидетельствуют результаты световой и электронной микроскопии, а также данные типирования лимфоцитов в опухолевых биоптатах с использованием моноклональных антител. Сочетание последнего метода со световой микроскопией также позволило выявить прочный межклеточный контакт между лимфоцитом и опухолевой клеткой.

6. ЦИ, согласно данным ЭЭГ, может повышать функциональную активность головного мозга, действуя как ноотропный препарат вне зависимости от использованного клинического подхода (до или после открытого нейрохирургического вмешательства). Это позволило в послеоперационном периоде отказаться от применения ноотропных препаратов.

7. Катамнез, прослеженный у наших больных на протяжении 3,4 лет, позволяет сделать заключение о принципиальной возможности проведения комбинированного лечения глиом больших полушарий головного мозга, включающего в себя открытое хирургическое вмешательство и цитокиновую иммунотерапию в до- и/или послеоперационном периоде. Указанный подход отличается от описанных ранее в литературе, когда цитокиновая иммунотерапия используется как «средство отчаяния», т.е. после установления неэффективности хирургического и химиолучевого методов лечения.

8. Цитокиновая иммунотерапия на сегодняшний день является одним из методов дополнительного воздействия на опухолевые клетки, позволяющим улучшить результаты комбинированного лечения, и не конкурирует с открытым нейрохирургическим вмешательством, направленным на максимально полное удаление внутримозговой опухоли.

9. Иммунологические исследования головного мозга в последние десятилетия, а также данные, полученные в настоящем исследовании, позволяют считать устаревшим понятие о головном мозге как об «иммунологически привилегированном» органе и ввести новый термин — «относительная иммунологическая автономность головного мозга». Накопленный опыт изучения ВОГМ с точки зрения формирования ими своей собственной макро- и микроструктурной организации, а также результаты, полученные в ходе настоящей работы, позволяют отказаться от неоправданно широкого использования термина «гемато-энцефалический барьер» при глиомах головного мозга и предложить использовать вместо него термин «гемато-туморальный барьер» (ГТБ).

.У всех больных количество ЛАК клеток в см³ = 5х10⁶

* — судьба не известна

Литература