Российский онкологический журнал. № 6. 2000.

Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторные исследования

Эффективность традиционных методов плевродеза при опухолевых плевритах составляет 60-80% [1, 2, 12-14, 16], однако внутриплевральное введение некоторых цитостатиков и (или) склерозирующих агентов у 28-60% больных сопровождается побочными эффектами, из которых наиболее частыми являются боль и лихорадка [12, 16]. В 90-х годах появились сведения о применении цитокинов; главным образом интерлейкина-2 (ИЛ-2) [18], интерферона [5] и фактора некроза опухолей [15]. Наиболее эффективным (до 94,8%) оказалось сочетание ИЛ-2 или других иммуномодуляторов с лимфокинактивированными клетками-киллерами (ЛАК) [4, 6, 9-11]. ЛАК —это клетки-киллеры, генерированные in vitro из лимфоцитов плеврального экссудата в присутствии ИЛ-2 и затем возвращенные («adopted») в организм. Преимущества адоптивной ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии при опухолевых плевритах различной этиологии объясняются противоопухолевым действием клеток-киллеров, их способностью лизировать опухолевые клетки [3, 4, 9]. При этом метод характеризуется отсутствием побочных эффектов, кроме кратковременного повышения температуры [9, 10|.

Следует отметить, что метод ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии сопряжен с применением специальной технологии разделения экссудата на плазменную и клеточную части, выделением лимфоидных и опухолевых клеток. Это позволяет осуществить ранее не реализованную возможность улучшения качества жизни больного посредством реинфузии плазменной части, надежно очищенной от опухолевых клеток.

Первый опыт ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии, описанный в зарубежных публикациях [4, 6, 9-11, 20], еще не нашел применения в России. Однако очевидна перспективность разработки этого метода, необходимость его обоснования результатами лабораторных и клинических исследований.

С декабря 1997 г. по май 1999 г. проведено лечение 25 больных: раком легкого (11), молочной железы (7), гортани, щитовидной железы, яичников, мезотелиомой плевры (2), а также метастатическим опухолевым плевритом при невыявленном первичном очаге (2). Мужчин было 14, женщин — 11. 5 больных в возрасте до 45 лет, 12 — от 45 до 59 лет и 8 больных — 60 лет и старше. Состояние больных расценивалось как средней тяжести (у 22) и тяжелое (у 3). До начала ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии 13 больным проводили противоопухолевое лечение: хирургическое (2), лучевую (5) и химиотерапию (6), в том числе с внутриплевральным введением цитостатиков (4). Перед началом иммунотерапии из плевральной полости удаляли от 200 до 2800 мл серозного или серозногеморрагического экссудата. Всем больным проводили цитологическое исследование плеврального выпота (плоскоклеточный рак — 3, аденокарцинома — 20, мезотелиома — 2). Диагноз мезотелиомы плевры подтвержден иммуноморфологическими исследованиями.

Для проведения ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии плевральную полость дренировали катетером на 2-4 нед. Экссудат эвакуировали в стерильные емкости с гепарином (20 ЕД/мл) и путем центрифугирования (1000 об/мин, 20 мин) разделяли на клеточную и плазменную части. Плазменную часть в тех случаях, когда проводили ее реинфузию, дополнительно центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин и после цитологического контроля элиминации клеточной фракции, бактериологического и биохимического исследований возвращали внутривенно. Из клеточной фракции выделяли мононуклеарные клетки (МНК) и опухолевые. Из МНК генерировали ЛАК, опухолевые клетки использовали для оценки цитотоксической активности МНК и ЛАК. Все больные получили 1-3 курса ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии. Каждый курс состоял из 5-20 внутриплевральных инъекций ИЛ-21 в дозе 0,5-1,0 млн ME и 2-8 инъекций ЛАК по 50— 100 млн клеток. Курс лечения продолжался от 1 до 4 нед.

Эффективность лечения оценивали по срокам накопления экссудата и изменению его клеточного состава (уменьшению числа опухолевых и увеличению числа лимфоидных клеток). За полный эффект, по определению М. Б. Бычкова [1], принимали отсутствие плеврального выпота в течение 1 мес. Частичный эффект соответствовал незначительному накоплению жидкости в отграниченных полостях, что не требовало ее удаления.

МНК получали из плеврального экссудата с использованием техники сепарации Ficoll-Hypague («Sigma») [3]. МНК суспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением гентамицина, глутамина и ИЛ-2 в концентрации 1000 МЕ/мл. Проводили инкубацию МНК в течение 3-5 дней в СО₂-инкубаторе (при 37°С, в атмосфере 5% СО₂). За этот срок концентрация МНК возрастала с 2 млн до 3-4 млн в 1 мл. Затем клетки отмывали от среды, разводили в изотоническом растворе хлорида натрия и вводили внутриплеврально.

Эвакуированную плевральную жидкость центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин. После инкубации МНК с ИЛ-2 in vitro клеточную взвесь центрифугировали 5 мин с помощью цитоцентрифуги «Cytospin-3» («Shadon») при 1500 об/мин. Мазки после высушивания на воздухе окрашивали по Лейшману.

Для подтверждения трансформации клеточной популяции МНК в активированные лимфоидные клетки под действием ИЛ-2 применяли иммуноцитохимический метод. Иммуноцитохимическую реакцию МНК с моноклональным антителом СД25 ставили на 3-и и 5-е сутки после начала их инкубации с ИЛ-2. Исследование проводили по стандартной методике с использованием моноклональных антител НПЦ «Медбиоспектр».

Для определения противоопухолевой активности (цитотоксичности) МНК экссудата и генерированных из них ЛАК использовали аутологичные опухолевые клетки, которые выделяли из плеврального экссудата центрифугированием в двойном градиенте плотности по К. Shiiba и соавт. [17]. Опухолевые клетки (1х104) инкубировали в культуральной среде с МНК или ЛАК (в соотношении 1:5) в плоскодонных 96-луночных микропланшетах («Costar») в течение 18 ч. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ («Sigma») и по оптической плотности, измеряемой на мультискане МСС-340 («Labsystem»), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).

Исследование показало эффективность предложенного иммунологического плевродеза как в плане прекращения или существенного уменьшения экссудации, так и по длительности клинического эффекта. Кроме того, клинические данные получили лабораторное подтверждение.

Клинические исследования

Как правило, эффект лечения определяли после 2-3 нед лечения. За этот срок прекращение экссудации достигнуто у 12 больных, существенное меньшение — у 8. Еще 2 больным для прекращения экссудации потребовалось 4 нед лечения. Через 1 мес после окончания ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии полный эффект лечения сохранялся у 14 (56%) больных, частичный — у 8 (32%). У 3 больных раком молочной железы отмечено отсутствие эффекта — экссудация продолжалась, хотя и в существенно меньшем количестве. Следует отметить, что замедление или прекращение экссудации наступало только в тех случаях, когда в плевральном выпоте отмечалось значительное количество активированных лимфоидных клеток с наличием иммунобластов и митозов.

Обращают внимание хорошая переносимость иммунотерапии, отсутствие осложнений, тенденция к более выраженному эффекту при более химиорезистентных опухолях (немелкоклеточный рак легкого, мезотелиома плевры и др.). Уменьшение и прекращение экссудации подтверждались рентгенологически. Иммунологический плевродез сопровождался в отдельных наблюдениях снижением показателей опухолевых маркеров, нормализацией иммунного статуса, уменьшением размеров и плотности метастатически измененных надключичных лимфатических узлов. Устранение плеврита позволяло осуществлять лечение, которое планировали до выявления плеврального экссудата: в 1 случае проведена лучевая и в 3 — химиотерапия по поводу немелкоклеточного рака легкого, в остальных осуществлялось динамическое наблюдение в течение 2-5 мес. Течение заболевания в этом временном интервале характеризовалось иными проявлениями опухоли, в том числе ее прогрессированием, однако без признаков опухолевого плеврита.

Поддержание гомеостаза посредством реинфузии плазменной части экссудата после элиминации опухолевых клеток проведено у 4 больных, находившихся в стационаре. Показания к таким реинфузиям обусловливались тяжестью общего состояния больных, безбелковыми отеками, гипоальбуминемией. Переносимость инфузий была удовлетворительной, побочных эффектов не наблюдалось.

Лабораторные исследования

В плевральном выпоте до лечения выявлялось, как правило, значительное количество опухолевых клеток. Также определялись клетки мезотелия, гистиоидные клетки, макрофаги, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты. Лимфоидные элементы были представлены преимущественно зрелыми лимфоцитами. В цитограмме экссудатов плоскоклеточного рака по сравнению с железистым отмечался более выраженный воспалительный компонент с признаками клеточного распада. В процессе лечения обращала внимание адгезия лимфоцитов к опухолевым клеткам (как начальный визуализируемый этап их последующего лизиса в результате противоопухолевого эффекта ЛАК). Через 1-2 нед лечения в экссудате определялись лишь единичные опухолевые клетки с явлениями дегенерации, и, напротив, значительно увеличивалось число лимфоидных клеток. При достижении полного эффекта опухолевые клетки не определялись.

Мониторинг экстракорпоральной генерации ЛАК показал, что при активации ИЛ-2 МНК экссудата на 3-и сутки происходила пролиферация лимфоцитов, появлялись лимфоидные элементы различной степени зрелости, регистрировались единичные митозы. На 5-е сутки возрастало число крупных активированных лимфоцитов типа пролимфоцитов, появлялись клетки типа иммунобластов, повышалось количество митозов. Подобные изменения расценены как реакция бласттрансформации, подтверждающая активацию лимфоидных клеток.

Результаты иммуноцитохимической реакции с моноклональным антителом СД25 показали, что у всех больных исследованные МНК на 3-5-е сутки после их инкубации с ИЛ-2 in vitro оказывались СД25 положительными, что свидетельствует о транформации клеточной популяции МНК в активированные клетки под действием ИЛ-2.

Лабораторные и клинические данные (выраженное повышение цитотоксичности ЛАК против аутологичных опухолевых клеток, прекращение экссудации) подтверждают эффективность анализируемого метода. Представляет особый интерес объяснение достигаемого эффекта. Изменения в процессе трансформации МНК плеврального экссудата под действием ИЛ-2 свидетельствуют об активации лимфоидных клеток, которые начинают оказывать клинически значимое противоопухолевое действие. Доказательствами этого являются результаты цитологических исследований, показавшие, что популяция активированных МНК на световом уровне была представлена преимущественно лимфоидными элементами с наличием укрупненных клеток типа пролимфоцитов и иммунобластов, а также результаты иммуноцитохимической реакции с моноклональным антителом СД25: исследованные клетки после их активации ИЛ-2 оказывались СД25-положительными, т. е. положительными по отношению к данному антигену, который, как известно, экспрессируется только на активированных МНК. Таким образом, клеточная популяция МНК на 3-5-е сутки после инкубации с ИЛ-2 становится активированными лимфоидными клетками — действующим началом адоптивной иммунотерапии.

ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапия расширяет возможности противоопухолевого лечения. Более того, она имеет преимущества по сравнению с традиционными методами. В отличие от неспецифических склерозирующих агентов (тальк, тетрациклин, доксициклин и т. п.), приводящих к развитию грануляционной ткани, которая затем инфильтрируется опухолью [14], иммунотерапия стимулирует местный противоопухолевый клеточный иммунитет, приводит к лизису опухоли. Ее также выгодно отличают от химиотерапии отсутствие проявлений токсичности, возможность применения в случаях лекарственной резистентности. Наконец, новый метод позволяет улучшать качество жизни посредством реинфузии плазменной части экссудата. Внедрение ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии в клиническую практику теперь, после разработки эффективных отечественных препаратов Лимфокинина и Ронколейкина^®, сдерживается лишь освоением сложной методики, а также необходимостью должного лабораторного оснащения.

Материалы исследования соответствуют сведениям литературы [3, 6, 9, 10, 17-20] об универсальности метода — возможности его применения при различных (в том числе относительно химиорезистентных) нозологических формах (немелкоклеточном раке легкого, мезотелиоме плевры и др.).

Безусловно, важно оценить эффективность метода в плане комбинированного лечения, прежде всего сочетания иммунотерапии с химиотерапией. Очевидно, что одновременное внутриплевральное проведение химиоиммунотерапии нерационально, так как лабораторные исследования выявляют подавление лимфоидных клеток при введении химиопрепаратов. Вопрос о последовательности применения лечебных методов остается нерешенным до подведения итогов (уже начатых в РОНЦ) проспективных исследований. Имеющиеся наблюдения, в которых положительные результаты ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии достигнуты при отсутствии эффекта предшествовавшей химиотерапии, позволяют констатировать, что ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапия возможна и в качестве первоочередного противоопухолевого воздействия, особенно при выраженной экссудации, а также химиорезистентности новообразования.

Литература