Пособие для врачей . СПб: изд-во СПб ун-та, 2002. 28 с.

Эффективность цитокинотерапии Ронколейкином^®
в комплексном лечении хирургических инфекций

Останин А.А., Черных Е.Р.
НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Пособие для врачей посвящено вопросу применения лекарственной формы рекомбинантного интерлейкина-2 человека Ронколейкина^® (номер государственной регистрации Р №000122/01-2000; производство ООО «БИОТЕХ», Санкт-Петербург) в лечении гнойно-септических заболеваний и инфекционных послеоперационных осложнений у больных хирургического профиля. В пособии рассматриваются вопросы патогенетического обоснования применения цитокинов, предлагается схема цитокинотерапии, показания и противопоказания к использованию Ронколейкина^®, с позиций доказательной медицины оценивается клиническая эффективность, детоксикационное и иммунокорригирующее действие Ронколейкина^®. Пособие предназначено для хирургов, врачей-реаниматологов, клинических иммунологов и студентов старших курсов медицинских вузов.
В подготовке пособия принимали участие:
Леплина О.Ю. (ИКИ СО РАМН),
Тихонова М.А. (ИКИ СО РАМН),
Овечкин А.В. (Муницип. гор. клин. боль-ца №12),
Агеев Н.Л. (Муницип. гор. клин. боль-ца №1),
Захарова Н.Ф. (Муницип. гор. клин. боль-ца №2),
Стрельцова Е.И. (Новосибирская обл. клин. бол-ца ).

ВВЕДЕНИЕ

Рост частоты и тяжести гнойно-септических заболеваний и послеоперационных осложнений в хирургической практике в последние годы вызывает особую тревогу. Так, по данным Савельева В.С., гнойно-воспалительные заболевания составляют 35-40 % среди всех госпитализируемых в хирургические отделения больных, а частота развития послеоперационных инфекционных осложнений достигает в среднем 30 %. Актуальность проблемы обусловлена также сохраняющимся уровнем летальности, который при таких тяжелых и генерализованных формах хирургической инфекции, как разлитой гнойный перитонит (РГП) и сепсис, варьирует от 30 до 75 %. В настоящее время даже в странах с высоким уровнем медицинской и социальной помощи населению средний уровень летальности при сепсисе составляет 35 %, а у пациентов с септическим шоком достигает 60-70 % .

В 1991 г. в Чикаго была проведена Согласительная конференция американского колледжа пульмонологов и общества медицины критических состояний (ACCP/SCCM), на которой в основу патогенеза сепсиса был положен, так называемый, синдром системного воспалительного ответа (SIRS, systemic inflammatory response syndrome). SIRS представляет первичный ответ организма на различные повреждающие стимулы (травма, ожог, массивное хирургическое вмешательство) и обусловлен выбросом в циркуляцию медиаторов воспаления, главным образом, провоспалительных цитокинов. В свете данной концепции сепсис является системной воспалительной реакцией, которая развивается в ответ на бактериальную агрессию и диагностируется по наличию как минимум двух клинико-лабораторных критериев SIRS.

Ключевыми медиаторами SIRS (рис. 1) являются провоспалительные цитокины, которые продуцируются макрофагами и Т-клетками в ответ на стимуляцию бактериальными антигенами. Так, эндотоксин грамотрицательных бактерий стимулирует макрофаги к продукции ФНО-альфа, IL-1, IL-12, IL-8, IL-6. Экзотоксины, суперантигены грампозитивных бактерий активируют Т-клетки и моноциты к продукции IL-2, ИФН-гамма, ФНО-альфа и IL-1. Провоспалительные цитокины играют защитную роль, поскольку обеспечивают рекрутирование в очаг инфекции дополнительное количество эффекторных клеток (нейтрофилов, макрофагов), стимулируют их фагоцитарную, бактерицидную активность и индуцируют запуск антигенспецифического ответа, что в совокупности способствует элиминации патогена.

Рис.1 Цитокины в развитии системной воспалительной реакции.

Важно отметить, что защитная роль провоспалительных цитокинов проявляется тогда, когда эти медиаторы работают локально, в очаге воспаления, однако их системная продукция не означает высокой эффективности противоинфекционного иммунитета. Напротив, избыточная и генерализованная продукция провоспалительных циткоинов приводит к развитию бактериально-токсического шока и органных дисфункций, что является причиной летального исхода на ранних этапах септического процесса.

Для избежания избыточных проявлений системного воспаления вслед за SIRS в организме включаются механизмы негативного контроля, опосредованные продукцией противовос палительных цитокинов и растворимых ингибиторов провоспалительных цитокинов. Для обозначения данного состояния R. Bone в 1996 г. предложил использовать акроним CARS, или синдром компенсаторного противовоспалительного ответа (compensatory antiinflammatory response syndrome) (рис. 2).

Рис.2 Цитокины в развитии системной противовоспалительной реакции.

При сбалансированном течении CARS подавляет системную воспалительную реакцию и приводит к восстановлению гомеостаза. В то же время при чрезмерной выраженности или пролонгированном течении CARS вызывает развитие глубокой иммунодепрессии, что клинически проявляется хронизацией или диссеминацией инфекции, присоединением нозокомиальной микрофлоры, нарушением процесса репарации, утяжелением эндотоксикоза и формированием поздней полиорганной недостаточности, что в совокупности предопределяет летальный исход на поздних этапах септического процесса.

Таким образом, основой патогенеза сепсиса является запуск цитокинового каскада, который включает, с одной стороны, провоспалительные цитокины, а с другой — противовоспалительные медиаторы. Баланс между двумя оппозитны ми группами во многом определяет характер течения и исход гнойно-септических заболевания. Соответственно управление цитокиновым балансом рассматривается в настоящее время как новая мишень терапевтических воздействий при лечении гнойно-септических заболеваний. Очевидно, что противовос палительная, например, антицитокиновая терапия оправдана только в случае крайней выраженности системного воспалительного ответа (при угрозе развития или на пике септического шока). Наоборот, при несбалансированном или пролонгированном течении CARS показано применение препаратов с провоспалительной активностью, среди которых наиболее перспективным представляется использование провоспалительных или Тh1-цитокинов (IL-1, IL-12 или IL-2, ИФН-гамма). Как известно, цитокины этой группы наряду с усилением неспецифических механизмов противоинфекционной защиты эффективно стимулируют развитие специфического иммунного ответа и активируют репаративные процессы в поврежденных тканях. Кроме того, являясь функционально активными иммунорегуляторными факторами, цитокины не требуют значительного времени для реализации своего эффекта, что чрезвычайно важно при оказании неотложной медицинской помощи.

Среди цитокинов, которые в настоящее время находятся на пути активного внедрения в хирургическую практику, в частности для профилактики и лечения гнойно-септических заболеваний, интерлейкин-2 вызывает особый интерес. Применение IL-2 с целью коррекции иммунодепрессии при тяжелых и генерализованных формах хирургической инфекции было впервые предложено и запатентовано в 1989 году в Германии. В России препарат рекомбинантного IL-2 человека, разрешенный к клиническому использованию, появился в 1995 г. и получил коммерческое название «Ронколейкин ^®«. За прошедшие годы накоплен определенный опыт по применению Ронколейкина ^® при лечении тяжелых и генерализованных форм хирургической инфекции (сепсис, разлитой гнойный перитонит), ожогов, гнойных эндометритов, гнойно-деструктивных заболеваний бронхо-легочного аппарата и т.д. Однако следует признать, что большинство проведенных ранее исследований клинической эффективности Ронколейкина ^® проходило в дизайне «пилотных» испытаний. Поэтому в настоящее время назрела необходимость изучения эффективности Ронколейкина ^® на более высоком уровне клинических исследований, организованных в соответствии с методологией доказательной медицины («evidence-based medicine»).

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА

При проведении цитокинотерапии используют лекарствен ную форму рекомбинантного интерлейкина-2 человека «Ронколейкин^®» (номер государственной регистрации Р №000122/01-2000; производство ООО «БИОТЕХ», Санкт-Петербург). При проведении иммунологического мониторинга используется обычное для иммунологической лаборатории оборудование и реактивы.

ФОРМУЛА МЕТОДА

Предлагаемый метод цитокинотерапии, включенный в комплексное лечение хирургических больных с гнойно-септичес кими заболеваниями и осложнениями, отличается от существующего (патент на изобретение № 95104171/14 (008123) «Способ лечения иммуносупрессии при сепсисе у человека», дата приоритета 28.03.95 г.) тем, что препарат «Ронколейкин^®» используют в режиме двух подкожных инъекций (по 500 000 Ед с интервалом в 3 дня), при этом обоснованность и эффективность метода доказывается рандомизированными, двойными-слепыми, плацебо-контролируемыми испытаниями.

ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ ЦИТОКИНОТЕРАПИИ

На основании проведенных исследований определены следующие показания к цитокинотерапии с использованием Ронколейкина^®:

1. Сепсис любой этиологии, особенно на этапе несбалансиро ванного развития системного противовоспалительного ответа, проявляющегося формированием глубокой иммунодепрессии.

2. В постшоковом периоде у больных с купированными явлениями инфекционно-токсического шока любой степени тяжести.

3. Гнойные осложнения послеоперационного периода у больных с высокой степенью риска генерализации инфекции (перитонит, панкреонекроз, перфоративные язвы желудка и 12-перстной кишки, абсцессы в брюшной полости, кишечные свищи, обширные эвентрации; абсцедирующая пневмония, пиопневмоторакс, медиастенит; гнойно-некротические заболевания мягких тканей, пролежни, длительно не заживающие трофические язвы и др.), сопровождающиеся нарастанием явлений эндотоксикоза и прогрессирующей иммунодепрессией.

4. Вялотекущие гнойные процессы при неэффективности предшествующей традиционной терапии (антибактериальной, детоксикационной, инфузионной, противовоспалительной и т.д.).

5. Любые инфекционно-воспалительные, послеоперационные осложнения, развивающиеся у исходно иммунокомпроме тированных больных (лица пожилого и старческого возраста; с тяжелой, хронической сопутствующей патологией; с клиническими признаками вторичного иммунодефицита) или же при выполнении объемных оперативных вмешательств.

6. Диагностированное состояние иммунодепрессии, которое подтверждается одним из следующих лабораторных признаков:

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ ЦИТОКИНОТЕРАПИИ

Цитокинотерапию с использованием Ронколейкина ® не рекомендуется проводить в следующих случаях:
1. Неадекватно проводимое хирургическое лечение гнойного процесса, связанное с неустраненной причиной или недостаточной санацией гнойного очага.
2. У больных с некупированным инфекционно-токсическим шоком, острым респираторным дистресс-синдромом, синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертывания.
3. Терминальное состояние больного с явлениями выраженной декомпенсации жизненно-важных органов и систем (IV стадия полиорганной недостаточности по шале SOFA).

Важно отметить, что обнаружение у больного клинической симптоматики синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) не является противопоказанием к проведению цитокинотерапии Ронколейкином^®, поскольку было установлено, что больные с клиникой SIRS хорошо отвечают на проводимую цитокинотерапию и ни у одного больного использование Ронколейкина^® не сопровождалось дальнейшей эскалацией системной воспалительной реакции.

ОПИСАНИЕ МЕТОДА (МЕТОДОЛОГИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ)

Оценка эффективности Ронколейкина^® в комплексном лечении больных с гнойно-хирургической патологией проводилась в дизайне рандомизированных, двойных-слепых, плацебо-контролируемых клинических испытаний (приложение 1).

В исследование включались оперированные больные старше 16 лет с гнойно-септическими заболеваниями и/или послеоперационными осложнениями, при которых очаг инфекции был локализован в брюшной или грудной полости или в мягких тканях. Основным критерием эффективности Ронколейкина^® являлось отсутствие летального исхода в течение 28 дней после окончания цитокинотерапии. Дополнительными критериями эффективности служила коррекция иммунных дисфункций и регрессия клинико-лабораторных проявлений эндотоксикоза в течение 3-5 дней после окончания терапии Ронколейкином^®.

Курс лечения включал две подкожные инъекции Ронколейкина^® (по 500 000 Ед, 1 раз/день, с интервалом в 3 дня), либо плацебо (идентичный препарат, который в своем составе содержит только наполнитель и стабилизатор в отсутствии rIL-2). При проведении лечения ни лечащий врач, ни пациент не знали о варианте проведения терапии (двойное-слепое исследование). Больные, включенные в исследование, попадали в основную клиническую группу или в контрольную группу-плацебо на основе случайного распределения (т.е. в результате процедуры рандомизации). Работа по протоколу проводились абсолютно бесплатно для всех больных и с информированного согласия либо самого пациента, либо его ближайших родственников.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

В исследование были включены 100 больных с гнойно-хирургической патологией (56/44 % мужчин и женщин, средний возраст 44,6 ± 1,7 лет).

Из данных табл. 1 видно, что у большинства пациентов очаг инфекции был локализован в брюшной полости (56 %), а также в мягких тканях (33 %) или в легких/средостении (11 %). У 42 больных цитокинотерапию проводили на ранних этапах инфекционно-воспалительного процесса (< 5 сут; в среднем на 2,7 ± 0,2 сутки), тогда как в оставшихся 58 % случаях Ронколейкин использовали по поводу уже развившихся гнойно-септических осложнений в более поздние сроки заболевания (в среднем на 15,6 ± 1,8 сутки). Среди наиболее тяжелых осложнений разлитой гнойный перитонит (РГП) был зарегистрирован у 55,5 % (31/56) больных с острыми воспалительными заболеваниями органов брюшной полости. В 68 % случаев (68/100 больных) течение основного заболевания осложнялось развитием сепсиса (у 57 % больных - абдоминального и у 26,5 % пациентов - раневого). Диагноз сепсиса определяли в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции ACCP/SCCM по двум критериям:
1) наличие очага инфекции (клинически выявленного или подтвержденного микробиологически в 61 % случаев);
2) клиническая манифестация синдрома системного воспалительного ответа. На момент обследования у 26,5 % больных обнаруживался тяжелый сепсис, сочетающийся с органными дисфункциями (табл. 2). Наличие 2, 3 и 4 клинических признаков SIRS было выявлено соответственно в 20,6, 42,5 и 10,4 % случаев. Клинико-лабораторные проявления синдрома эндогенной интоксикации средней, тяжелой и крайне тяжелой степени выраженнос ти были зарегистрированы в 19, 44 и 37 % случаях соответственно. При этом у обследованных больных в целом по группе отмечалось значительное увеличение лейкоцитоза (13,5 ± 0,7 х 10⁹/л), скорости оседания эритроцитов (СОЭ 39 ± 1,8 мм/час), лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ 6,5 ± 0,6 расч. ед.). Степень тяжести больных определяли также по системе APACHE-II и шкале SAPS. В первом случае средний балл составил 6,2 ± 0,4, а во втором — 8,5 ± 0,4 баллов, что позволяло прогнозировать вероятную летальность на уровне 14,7 ± 1,2 %. В подгруппах больных с сепсисом и с тяжелым сепсисом средние показатели по балльным системам APACHE-II и SAPS были выше, при этом уровень прогнозируемой летальности достигал 17-25 %.

Оценка исходного состояния иммунитета (приложение 2) показала наличие у больных с гнойно-хирургической патологией лабораторных признаков вторичного иммунодефицита (табл. 3). Обнаруживалось достоверное снижение количества HLA-DR-позитивных моноцитов, а также нарушение функциональной активности Т-лимфоцитов в виде снижения интенсивности спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации и продукции IL-2. Иммунные нарушения у больных с гнойно-септическими заболеваниями проявлялись также высокими значениями гибели лимфоцитов и нейтрофилов через механизм апоптоза. Кроме того, сыворотки крови больных характеризовались иммуносупрессорной активностью.

Следует отметить, что у значительной части обследованных нами больных обнаруживались наиболее глубокие изменения показателей иммунитета, т.е. такие изменения, при которых регистрируемые параметры выходили за установленные границы нормативного диапазона. Так, например, абсолютная лимфопения (<1,4 х 10⁹/л) и угнетение митогенной реактивности (<24 000 имп/мин) обнаруживались соответственно у 47 и 53 % больных. Критическое снижение КонА-индуцирован ной продукции IL-2 (<66 Ед/мл) и количества HLA-DR⁺ моноцитов (<30 %) регистрировались у 86 и 65 % пациентов соответственно. Высокий уровень апоптоза нейтрофилов (>18 %) и лимфоцитов (>10 %) выявлялся в 45-50 % случаев. Доминирующая супрессорная активность сывороточных факторов (ИСА <0,8) обнаруживалась у 55 % больных.

Таким образом, проведенная оценка иммунитета показала наличие у больных с гнойно-хирургической патологией вторичного комбинированного Т-лимфоцитарно-моноцитарного иммунодефицита, который у значительной части пациентов имел характер глубокой иммунодепрессии. Выявленные дефекты в системе иммунитета прямо свидетельствуют о целесообраз ности включения методов иммунотерапии/иммунокоррекции в комплексное лечение хирургической инфекции.

Исследования эффективности Ронколейкина^® были проведены на 4 клинических базах г. Новосибирска. По разработанному протоколу было пролечено 50 больных в основной группе и 50 человек в контрольной группе-плацебо. Из данных табл. 4 видно, что основная группа и группа-плацебо были однородны по полу и возрасту больных, по локализации первичного очага инфекции, по структуре клинических синдромов сепсиса, по степени тяжести больных и уровню прогнозируемой летальности.

Включение Ронколейкина^® в программу комплексного лечения больных с гнойно-хирургической патологией сопровождалось клиническим улучшением в 74 % случаев (табл. 5), что проявлялось 2-кратным снижением среднего балла по шкалам APACHE-II и SAPS. У 68% больных регистрировалось также ослабление степени тяжести эндотоксикоза в виде обрыва лихорадки, нормализации гемодинамики, достоверного снижения лейкоцитоза, лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), увеличения относительного и абсолютного количества лимфоцитов, улучшения биохимических показателей крови (табл. 6). В группе-плацебо клинический эффект обнаруживался достоверно реже — только в 32 % случаев (Р_Х²=0,0001), тогда как у остальных пациентов либо вообще не отмечалось заметной клинической динамики, либо она была отрицательной. При оценке лабораторных показателей в целом по группе регистрировалось умеренное снижение среднего бала по шкале SAPS, лейкоцитоза и ЛИИ, а также увеличение относительного количества лимфоцитов.

Цитокинотерапия Ронколейкином^®характеризовалась не только детоксикационным эффектом, но и выраженным иммунокорригирующим действием. Из данных табл. 5 видно, что у 61,5% больных основной клинической группы очень быстро, т.е. уже через 3-4 дня после завершения иммунотерапии, происходила коррекция измененных показателей иммунитета. В то же время в группе-плацебо в большинстве случаев при повторном иммунологическом обследовании регистрировалось или отсутствие какой-либо динамики (у 50% больных), или дальнейшее снижение параметров иммунитета (у 42% больных).

Иммунокорригирующий эффект цитокинотерапии особенно четко проявлялся при сравнении больных из оппозитных подгрупп с исходно сниженными параметрами иммунитета, т.е. с абсолютной Т-лимфопенией и низкой митогенной реактивностью Т-клеток (табл. 7).

Видно, что только на фоне применения Ронколейкина^®, но не препарата-плацебо у больных происходит достоверное увеличение абсолютного количества основных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+ Т-клеток). Отмечается положительная динамика не только количественных, но и функциональных параметров. При этом регистрируется достоверное усиление пролиферативного ответа Т-клеток на митоген, а также 2-кратное снижение уровня спонтанного и активационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов в культуре in vitro.

В итоге при практически равных значениях прогнозируемой летальности фактическая 28-суточная летальность в группе-плацебо составила 12% (табл. 5), тогда как использование Ронколейкина^® позволило снизить уровень летальности больных в целом по группе до 2% (Р_Х²=0,05), в том числе в подгруппе больных с хирургическим сепсисом с 18 до 3% (Р_ТМФ=0,04) и в подгруппе больных с тяжелым сепсисом, осложненным развитием полиорганных дисфункций, с 44,5 до 11% (Р_ТМФ=0,14).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ронколейкин^® является иммунотропным, цитокин-содержащим препаратом нового поколения, включение которого в программу комплексного лечения больных с гнойно-хирургической патологией характеризуется быстрым детоксионным и иммунокорригирующим действием и позволяет значительно повысить эффективность проводимой терапии. Объективными критериями лечебного эффекта препарата служат: снижение уровня летальности, достоверное уменьшение интегрального показателя степени тяжести больного по шкалам APACHE-II или SAPS, усиление процесса репарации и более быстрое заживление ран, сокращение сроков госпитализации и уменьшение стоимости лечения.

Клинические эффекты Ронколейкина^® связаны с его способностью стимулировать противоинфекционный иммунитет. Доказано, что IL-2 протектирует развитие апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов, предотвращает развитие функциональной анергии Т-клеток, усиливает продукцию антител активированными В-лимфоцитами, нормализует нарушенный баланс про- и противовоспалительных цитокинов, опосредованно через стимуляцию продукции ИФН-гамма натуральными киллерами (NK-клетками) и T-хелперами 1-го типа, восстанавливает функциональную активность клеток моноцитарно/макрофагально го ряда и цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и NK-клеток. В конечном итоге Ронколейкин^® повышает эффективность работы механизмов и неспецифической резистентности (врожденного иммунитета) и антиген-специфического иммунного ответа (приобретенного иммунитета), что в совокупности способствует более быстрой элиминации этиопатогенных микроорганизмов.

Применение Ронколейкина^®, как и других цитокин-содержащих препаратов, должно проводиться под наблюдением врача. Нами не было зарегистрировано каких-либо серьезных побочных явлений при использовании Ронколейкина^® по предложенной схеме. Опыт клинического применения Ронколейкина^® свидетельствует о его хорошей переносимости и отсутствии токсичности. В отдельных случаях после проведения терапии Ронколейкином^® у больных может отмечаться развитие, так называемых «цитокиновых реакций» в виде кратковременного озноба, подъема температуры тела до 38,5-39⁰С, умеренного акроцианоза. Развитие таких реакций свидетельствует о восстановлении реактивности больного и, как правило, не требует медикаментозной коррекции. Таким образом, Ронколейкин^®является высокоэффективным иммунотропным лекарственным препаратом, удобным в применении, практически не дающим побочных/токсических эффектов, что позволяет широко использовать его в хирургической практике.

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bone R.C., Balk R.A., Cerra F.B., et al. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis // Chest. 1992. Vol.101. Р.1644 -1655.
2. Bone R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS // Crit. Care. Med. 1996. Vol.24. Р.1125 -1129.
3. Bone R.C., Godzin C.J., Balk R.A. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of the disease process // Chest. 1997. Vol.112. Р.235- -243.
4. Ostanin A.A., Leplina O.Yu., Shevela C.Ya., Kozhevnikov V.S., Chernykh H.R. The immunological markers of the major systemic inflammatory syndromes (SIRS, MARS, CARS) in patients with surgical infection // Russian J. Immunology. 2000. Vol. 5, № 3. Р. 289 -301.
5. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Пальцев А.В., Останин А.А. Цитокиновый баланс в патогенезе системного воспалительного ответа: новая мишень иммунотерапев тических воздействий при лечении сепсиса // Мед. иммунология. 2001. Т. 3, № 3. С. 41-429.
6. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Методические рекомендации по оценке иммунного статуса человека // Экологическая иммунология. М., 1995. С. 106 -177.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

Иммунотерапия с использованием «Ронколейкина^®» в режиме
подкожных инъекций в лечении хирургических больных
с гнойно-септическими заболеваниями
(Протокол клинического исследования)

1. Название исследования

Оценка эффективности и безопасности иммунотерапии с использованием Ронколейкина^®в режиме подкожных инъекций при лечении хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями.

2. Дизайн исследования

Двойное «слепое», рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование.

3. Цель исследования

Оценка эффективности и безопасности иммунотерапии в режиме двух подкожных инъекций Ронколейкина в дозе 500 000 Ед в лечении хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями.

4. Препараты, дозы и путь введения

Курс лечения включает в себя 2 подкожные инъекции Ронколейкина^® в дозе 500 000 ЕД, или препарата-плацебо с интервалом в 3 дня. Препарат разводят в 2 мл стерильного физиологического раствора и вводят п/к в область верхней трети плеча.

5. Длительность исследования

18 месяцев

6. Изучение эффективности

Основной параметр эффективности — отсутствие летального исхода в течение 28 дней после окончания цитокинотерапии. Дополнительные критерии эффективности — регрессия клинико-лабораторных проявлений эндотоксикоза (снижение температуры тела, стабилизация гемодинамики, восстановление устойчивой перистальтики у больных с РГП, нормализация показателей крови — ЛИИ, абсолютное количество лейкоцитов, лимфоцитов), а также коррекция показателей иммунитета через 3-5 дней после окончания цитокинотерапии.

7. Оценка безопасности

Частота побочных эффектов, динамика клинического состояния и лабораторных показателей.

8. Популяция больных

Тяжелые формы гнойно-воспалительных заболеваний органов брюшной полости, грудной полости и мягких тканей, в том числе осложненные сепсисом (или другими септическими состояниями в соответствии с классификацией ACCP/SCCM) или разлитым гнойным перитонитом, а также панкреонекроз с гнойно-некротическими осложнениями. Обязательным условием является выполненное хирургическое пособие, адекватная санация очага инфекции и возможность проведения антибактериальной терапии по предварительно согласованным схемам.

По 50 больных в основной клинической группе и в контрольной группе с применением препарата-плацебо.

8.3. Критерии включения

8.4. Критерии исключения

9. Выполнение исследования

Проводится сбор анамнестических данных, клиническое обследование больного (пульс, АД, температура, ЧД, суточный диурез). В день начала иммунотерапии проводится оценка тяжести общего состояния по шкалам APACHE-II и SAPS. В это же время проводится и лабораторное обследование, которое включает общий анализ крови с подсчетом форменных элементов крови, СОЭ, гематокрит; биохимический анализ крови (общий белок, креатинин, натрий, калий плазмы, мочевина плазмы, билирубин, сахар крови), оценку иммунного статуса. До лечения проводится бактериологическое исследование раневого отделяемого и/или посевы крови.

Больным будет проводиться один из двух вариантов лечения — двукратные п/к инъекции Ронколейкина^® в дозе 500 000 Ед (см. п.4) или препарата-плацебо. По завершении лечения (в течение 3-5 суток после окончания цитокинотерапии) выполняются контрольные исследования, включающие клиническое обследование, общий и биохимический анализ крови, бактериологическое исследование (по мнению исследователя), оценку иммунного статуса.

Антибактериальная терапия соответствующими препаратами обязательна. Использование в лечении больного других методов экстракорпоральной детоксикации организма на время проведения испытаний предпочтительнее исключить. Не допускается использование цитокин-содержащих препаратов в ходе всего исследования (лейкинферон, интерфероны, ростовые факторы, и т.д.).

Лечение прекращается в следующих случаях:

Приложение 2

Иммунологические исследования

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации 0,1х106/лунку культивируют в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки доноров IY (АВ) группы крови при 37⁰С в СО₂ инкубаторе. Для стимуляции клеток используют конканавалин А (КонA, 15 мкг/мл, Sigma).

Интенсивность пролиферации оценивают через 72 ч по включению Н³-тимидина (1 mКю/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования.

Методом проточной цитофлюориметрии (FACS, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела (ЗАО «Сорбент-сервис», Москва), определяют относительное содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+ и СD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов) и моноцитов, экспрессирующих HLA-DR антигены. При отсутствии цитофлюориметра идентификацию отдельных субпопуляций клеток можно выполнять в лимфоцитотоксическом тесте (по окрашиванию 2 % р-ром эозина) или с помощью цитофлюориметрического метода, используя соответствующие моноклональные антитела.

Методом проточной цитофлюориметрии определяют процентное содержание апоптотических клеток (лимфоцитов, нейтрофилов), которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании пропидиум иодидом (Sigma, 50 мкг/мл). Уровень апоптоза оценивают среди свежевыделенных клеток лейковзвеси, а также среди лимфоцитов, культивированных in vitro в течение 24 ч в безмитогенной среде (спонтанный апоптоз) или при стимуляции КонА (активационно-индуцированный апоптоз).

Наличие в сыворотке больных иммуносупрессорной активности определяют по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК тест-доноров (n=2-3) в присутствии 10% интактной сыворотки больных (опыт) в сравнении с уровнем митогенного ответа в присутствии 10% интактной сыворотки доноров (контроль). При этом рассчитывают индекс супрессорной активности (ИСА) по следующей формуле: ИСА = О+К.