ООО «БИОТЕХ»

РОНКОЛЕЙКИН® – РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИНТЕРЛЕЙКИН-2 ЧЕЛОВЕКА:
ФАРМАКОЛОГИЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Введение

Использование средств иммуноориентированной терапии является отличительной особенностью современной практической медицины. Лечение многих заболеваний без применения этих средств невозможно, и они входят в качестве обязательной составляющей в комплексную терапию. При этом эффективность медикаментозной коррекции дисфункций иммунореактивности зависит от природы используемого иммуномодулятора и специфичности его воздействия.
Спектр лекарственных средств, обладающих иммунотропной активностью, достаточно широк и разнообразен. Сегодня в клинической практике всё большее распространение получают рекомбинантные (генноинженерные) препараты, которые воспроизводят основные свойства естественных (эндогенных) цитокинов и являются эффективными иммунокорректорами [19, 38, 44, 50].

Структура, биологическая активность и механизмы действия большинства эндогенных цитокинов достаточно полно охарактеризованы, что позволяет получать их рекомбинантные аналоги методами современной биотехнологии в достаточных для клинического использования количествах и целенаправленно осуществлять иммунокоррекцию.

На современном этапе развития фармакологии цитокинам как лекарственным препаратам для целей иммунотерапии отводится особая роль. Цитокиновые препараты, восполняя дефицит эндогенных регуляторных и эффекторных молекул иммунной системы, обладают заместительными и универсальными индуктивными эффектами, а их иммунотропная активность многофакторна и не требует для своей реализации значительного времени. Кроме того, большинство цитокиновых препаратов не имеет противопоказаний для использования, что позволяет применять их в дозах, значительно превышающих физиологические. Метаболизм пиковых концентраций реализуется по естественным путям обмена эндогенных биомолекул, что резко уменьшает вероятность проявления побочных эффектов. При этом целевые эффекторные клетки активизируются даже в условиях устойчивых иммунодефицитных состояний. Это особенно актуально при тяжёлой инфекционной патологиии и онкологических заболеваниях [16, 18, 20, 59, 66].

Препарат Ронколейкин® — рекомбинантный интерлейкин-2 — является одним из представителей семейства лекарственных средств, используемых при проведении цитокинотерапии. Ронколейкин® обладает иммунокорригирующим действием, направленным на усиление противобактериального, противовирусного, противогрибкового и противоопухолевого иммунитета [24, 26].

Существенной особенностью IL-2 является его гидрофобность, что наиболее характерно для восстановленной формы молекулы, содержащей полный набор сульфгидрильных групп.

Ронколейкин®: состав препарата

Ронколейкин^® сухой для инъекций (Roncoleukin^®, регистрационное удостоверение № 000122/01-2000) — лекарственная форма рекомбинантного интерлейкина-2 человека (rIL-2), выделенного и очищенного из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат которых встроен ген человеческого IL-2 [55, 65].
Ронколейкин^® содержит в качестве активного начала рекомбинантный интерлейкин-2 (rIL-2), а также солюбилизатор — додецилсульфат натрия (ДСН), стабилизатор – D-маннит, восстановитель – дитиотреитол (ДТТ) и компоненты амоний-гидрокарбонатного буфера [54, 65] (табл. 1).

Ронколейкин^® выпускают в сухом виде в ампулах в дозах по 1мг (1 000 000 ME), 0,5 мг (500 000 ME), 0,25 мг (250 000 МЕ) действующего начала rIL-2.

Рекомбинантный интерлейкин-2 человека (rIL-2)

— белок с молекулярной массой 15300±200 Дa. rIL-2 человека — структурный и функциональный аналог эндогенного IL-2.

Информация о свойствах и структуре молекулы рекомбинантного IL-2 получены с использованием следующих методов: электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, оценки иммунологической идентичности, анализа аминокислотной последовательности молекулы rIL-2 и определения специфической биологической активности в тесте с IL-2 зависимой линией клеток CTLL-2 [54, 65].

С помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ-ЭФ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) можно оценить подвижность белковых молекул в поле постоянного электрического тока. Каждая молекула белка связывает значительное количество негативно заряжённых молекул ДСН, общий заряд которых превосходит общий заряд белка. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнёт двигаться в направлении положительного электрода. В порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие белки тормозятся значительно быстрее, чем малые. Вследствие этого сложная смесь белков делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Окрасив гель красителем кумасси синим, можно выделить основные фракции полипептидов. Сравнение местоположения полос анализируемых полипептидов и маркеров известных молекулярных масс, а также определение размера окрашенной полосы позволяет охарактеризовать качественный и количественный состав препарата.

Размер основной полосы, наблюдаемой после проведения ПААГ-ЭФ, соответствует 15 300 Дa, его содержание в препарате колеблется от 75% до 80 %. Выделенный белок 15 300 Дa показывает полную иммунологическую идентичность в тесте с моноклональными антителами к IL-2 человека и обладает специфической биологической активности в тесте с IL-2 зависимой линией клеток CTLL-2.
Антитела (АТ) были изготовлены по нашему заказу в НИИ гематологии и переливания крови (г.Минск, Белоруссия). Для получения АТ был использован секреторный рекомбинантный ИЛ-2 в окисленной и гликозилированной форме, полученный в лаб. биохимической генетики СПбГУ.
Анализ аминокислотной последовательности N-концевого фрагмента данного белка и пептидного состава триптического гидролизата, получаемого после переваривания белка 15 300 Да трипсином, также подтверждает его идентичность с эндогенным IL-2.

При электрофорезе, кроме основной полосы, присутствует дополнительная полоса, соответствующая низкомолекулярному белку 13 000 Дa, содержание которой в препарате составляет 15-20 %. Определение аминокислотной последовательности N- концевого фрагмента белка 13 000 Да показало, что он является укороченным вариантом белка 15 300 Да, начинающимся с 23-ей аминокислоты. «Интерлейкиновая природа» белка 13 000 Дa подтверждается тем, что он специфически взаимодействует с теми же моноклональными антителами, полученными к IL-2 с молекулярной массой 15 300 Дa, и также обладает специфической биологической активности в тесте с IL-2 зависимой линией лимфоцитов CTLL-2.

Оба белка выделяются только из дрожжевого экстракта штамма, трансформированного плазмидой с геном IL-2 человека, в дрожжевом экстракте контрольного штамма-реципиента оба белка отсутствуют.

В связи с тем, что белок 13 000 Да обладает меньшей удельной активностью и пониженной устойчивостью при хранении в растворе, при формулировании и обозначении количества rIL-2 в ампуле учитывают только количество rIL-2 с молекулярной массой 15 300 Да.

В препарате допустимо также незначительное содержание димеров указанных выше двух белков (не более 2 %).

Чистоту препарата Ронколейкин® определяют по суммарному содержанию белков «интерлейкиновой природы», что должно составлять не менее 93%.

Кроме белков «интерлейкиновой природы» в препарате допускается присутствие примесных (дрожжевых) белков, которое в сумме не должно превышать 5%.

Додецилсульфат натрия (ДСН) – солюбилизатор rIL-2

rIL-2, экспрессированный дрожжами не гликозилирован, полностью лишён дисульфидных связей и не активен. Вследствие гидрофобности восстановленной формы молекулы rIL-2 полностью не растворим. Для его солюбилизации используют буферы с большим содержанием ДСН (2-5%), способного оказывать влияние в высоких концентрациях (выше 0,1%) не только на третичную, но и на вторичную структуру белка [71]. ДСН, связываясь с гидрофобными участками белковых молекул, вызывает их развёртывание в длинные вытянутые цепи, которые хорошо солюбилизируются в растворе ДСН. Кроме того, в буферные растворы в качестве восстанавливающего агента добавляют 2-меркаптоэтанол (2-МЭ), разрушающий в белках дисульфидные связи.

Присутствие в буферных растворах на всех стадиях очистки ДСН и 2-МЭ позволяет сохранить белок в виде растворимого, полностью восстановленного неактивного мономера. В формулированном препарате на 1 мг rIL-2 приходится 10 мг ДСН. Вводимая с препаратом доза ДСН в 1500 раз ниже токсической.

Другие рекомбинантные препараты, например, Альдеслейкин [80, 88], представлены окисленной формой rIL-2, которая характеризуется меньшей гидрофобностью. Однако для повышения его растворимости в инъекционные лекарственные композиции также добавляют ДСН. Добавка ДСН к окисленному rIL-2 в Пролейкине составляет 0,20-0,23 мг на 1 мг белка.

Дитиотреитол (ДТТ) – восстановитель для rIL-2

Дитиотреитол применяется для того, чтобы защитить SH-группы rIL-2 от неконтролируемого окисления в период формулирования, стерилизации и розлива, когда происходит замена буфера с 2-МЭ на формулирующий. ДТТ предотвращает образование неправильных внутримолекулярных и межмолекулярных -S-S- связей, приводящих к формированию димеров и полимеров, биологическая активность которых значительно ниже, чем у мономерных молекул. Дитиотреитол широко используется для восстановления дисульфидных групп белков.

ДТТ присутствует в препарате как компонент буфера в концентрации, не превышающей 0,08 мг на ампулу, независимо от содержания в ней rIL-2, что в 70 000 раз ниже токсической.

D-маннит – стабилизатор для rIL-2

D-маннит используется для формирования таблетки. В препарате на 1 мг rIL-2 приходится 50 мг D-маннита.

Биологическая активность rIL-2

является основным критерием его соответствия эндогенному IL-2 человека. При титровании активности IL-2 определяют его способность поддерживать пролиферацию IL-2 зависимой линии цитотоксических лимфоцитов мыши или лимфоцитов периферической крови доноров [74-75, 76-77, 82, 85, 89-90].

Оценку биологической активности Ронколейкина® проводят в международном стандартном тесте с культурой IL-2-зависимых опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 [65]. Биологически активный rIL-2 должен стимулировать пролиферацию этих клеток. Определение биологической активности проводят с использованием колориметрического метода с тетразолиевым красителем МТТ. Жизнеспособные клетки, стимулированные IL-2 (rIL-2), поглощают краситель и накапливают в цитоплазме нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана (восстановленный МТТ). После удаления культуральной среды и полного растворения кристаллов в диметилсульфоксиде измеряют оптическую плотность полученного раствора на компьютеризованном фотометре при длине волны 540 и 690 нм. Тёмно-синее окрашивание раствора в пробах, содержащих rIL-2, должно быть зависимым от концентрации rIL-2, внесённого в культуральную среду. Кривые, отражающие зависимость измеренных значений оптической плотности в лунках от количества внесенного в них rIL-2 (стандартного образца или анализируемого препарата), имеют сигмоидную (S-образную) форму. Прямолинейный участок кривых, на котором оптическая плотность пропорциональна количеству rIL-2 в пробе, располагается в пределах от 0,2 ME до 50 ME. По величине оптической плотности определяют содержание IL-2 (rIL-2) в инкубационной пробе.

В соответствии с используемым колориметрическим методом за международную единицу активности (МЕ) rIL-2 принимается такое его количество, при котором оптическая плотность раствора, получаемого при растворении кристаллов формазана, соответствует 50% от максимального уровня окраски. Активность, отнесенная к единице массы (МЕ/мг), называется удельной активностью.

Определение биологической активности предусматривает использование соответствующих контролей [65].

Позитивный контрольный образец (ПКО) – раствор IL-2 человека, эталонного реагента Программы модификаторов биологических реакций (из Национального института рака, США) или откалиброванный по этому эталонному реагенту лабораторный образец rIL-2, хранящийся при минус 70⁰С и размораживаемый один раз для использования только в ходе одного определения.

Негативный контрольный образец (НКО) — среда RPMI 1640 для культивирования клеток CTLL-2, содержащая смесь вспомогательных веществ, входящих в состав Ронколейкина®: D-маннит, ДСН, NH4HCO3 в концентрациях, соответствующих их содержанию в испытуемом образце. Оптическая плотность НКО вычитается из оптической плотности ПКО.

ПКО и испытуемый образец разбавляют таким образом, что получается около 10 инкубационных проб, активность которых находится в области от 100 до 0,2 МЕ/мл.

Молекула rIL-2 становится биологически активной только после достижения определённой третичной структуры, при этом в физиологических условиях rIL-2 спонтанно принимает нативную конформацию.

Образованию нативной структуры rIL-2 и его окислению способствует понижение концентрации детергента (ДСН) [71]. Полное его устранение не желательно, поскольку он необходим для растворения белка.

Влияние ДТТ на активность rIL-2 не существенно: незначительное его количество в ампуле (5-10 мкг/мл) быстро окисляется кислородом воздуха и не препятствует конформационным преобразованиям rIL-2.

Выход окисленного мономера значительно возрастает при понижении концентрации rIL-2 в растворе до 1 мкг/мл, при этом одновременно снижается вероятность образования димеров и полимеров rIL-2. Следует заметить, что именно такая концентрация достигается в процессе растворения Ронколейкина® в 400 мл 0,9% NaCl (объём капельницы) при подготовке раствора для внутривенного введения препарата.

Для окисления rIL-2 также необходим кислород и следы катализатора — ионов меди (Cu++).

Восстановленная и окисленная формы rIL-2 человека, полученные из Е. сoli, существенно различаются по своей активности. Восстановленная форма rIL-2 обладает значительно более низкой удельной активностью – 2 400 000 МЕ/мг [74], окисленные формы rIL-2 , экспрессированные в Е. сoli, (Альдеслейкин, а также rIL-2 фирмы Hoffmann LaRoche) характеризуются более высокой биологической активностью [79, 85, 87].

Удельная активность rIL-2 имеет наибольшее значение для клиницистов, так как её величина определяет дозы, рекомендуемые при использовании Ронколейкина^®. В свою очередь, значение удельной активности зависит от методики её определения. В частности, на её величину влияет состав растворителя для rIL-2: 0,1 % ДСН или 0,9 % раствор NaCl (физиологический раствор), содержащий сывороточный альбумин человека (ЧСА).

Чем ниже концентрация ДСН, тем более структура rIL-2 приближается к структуре нативного белка, тем выше его удельная активность.
При растворении сухого Ронколейкина^® в 0,1% ДСН с последующим титрованием средой для роста клеток CTLL-2 (RPMI 1640) удельная активность Ронколейкина^® составляет (1 200 000 ± 400 000) МЕ/мг.

При растворении содержимого ампулы Ронколейкина^® в 400 мл 0,9% NaCl (объем капельницы) с добавлением 0,15% ЧСА удельная активность Ронколейкина^® возрастает в 10 раз и становится равной 12 000 000 МЕ/мг (табл. 2).

Данные о возрастании активности rIL-2 при растворении сухого Ронколейкина^® в физиологическом растворе с ЧСА совпадают с результатами исследований, проведённых в НИИ клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск). Биологическую активность rIL-2 Ронколейкина^® и референс-образца IL-2 определяли по их способности усиливать пролиферацию бластных клеток крови доноров, стимулированных фитогемагглютинином. Показано, что наиболее оптимальным условием для проявления активности rIL-2 в препарате является разведение Ронколейкина^® в забуференном физиологическом растворе с добавлением 0,1% ЧСА. В этом случае наблюдается 10-кратное увеличение активности rIL-2 по отношению к препарату, разведенному в 0,1% ДСН (табл. 2).

Изучению процессов окисления и восстановления rIL-2 посвящён ряд работ [71, 81, 91-94]. Исследователи, работавшие с рекомбинантными интерлейкинами-2, отмечают, что критическими для проявления биологической активности rIL-2 являются следующие структурные особенности молекулы: наличие дисульфидного мостика между цистеинами Cys58/Cys105 и наличие аминокислотных остатков Leu17 (лейцин в положении 17) и Trp121 (триптофан в положении 121). Приобретение молекулой rIL-2 третичной структуры, сопровождаемой образованием дисульфидного мостика Cys58/Cys105, приводит к переходу rIL-2 из восстановленной формы в окисленную.

В то же время активность rIL-2 не зависит от того, с какой аминокислоты начинается полипептид [92], а также от наличия цистеина в 125 положении (Cys125) или его замены на другие аминокислоты: серин (Ser125), аланин (Ala125) или аспарагин (Asp125) [71].

В настоящее время наиболее известными аналогами Ронколейкина^®являются два коммерческих препарата на основе rIL-2, экспрессированного кишечной палочкой (Е. сoli): Пролейкин (Альдеcлейкин) производится в США (фирма Cetus) и Европе (фирма Chiron), и rIL-2 фирмы Hoffmann LaRoche( HLR) производится во Франции.

Пролейкин (Альдеcлейкин), несмотря на отсутствие N-терминального аланина (Ala1) и замену цистеина в положении 125 (Cys125) на серин (Ser125), обладает аналогичной с нативным IL-2 удельной биологической активностью – 16 000 000 МЕ/мг.

rIL-2 фирмы Hoffmann LaRoche( HLR) отличается от нативного ИЛ-2 наличием метионина на N- конце молекулы. Его удельная активность составляет 12 000 000-15 000 000 МЕ/мг.

Указанные препараты содержат окисленную форму rIL-2, имеют одинаковую молекулярную массу, одинаковую фармакокинетику, не гликозилированы.

Предпринята попытка сравнить in vivo и in vitro эти два препарата [78]. Показаны количественные различия по активности и соответственно эффективности действия указанных лекарственных средств. При использовании одинаковой дозы 1 500 000 МЕ найдено, что rIL-2, входящий в состав препарата фирмы HLR, индуцировал освобождение в сыворотку крови большего количества растворимого a-рецептора IL-2, чем rIL-2 фирмы Chiron. С использованием метода проточной цитометрии также были выявлены количественные различия в способности этих двух рекомбинантных интерлейкинов-2 связываться с IL-2 рецепторами. Полученные результаты указывают на существенные различия в биологической активности этих препаратов: эффективность rIL-2 (HLR) примерно в четыре раза выше, чем rIL-2 (Chiron). Клиническое использование указанных препаратов показало, что наряду с большей активностью in vivo rIL-2 (HLR) проявляет и большую токсичность.

Клинический опыт демонстрирует более высокую токсичность бактериальных препаратов по сравнению с дрожжевым Ронколейкином^®. Лихорадка, тошнота, рвота, печеночная токсичность, наблюдаемые при их введении, не проявляются при использовании Ронколейкина^®, инфузии которого могут сопровождаться лишь кратковременным подъемом температуры. Ронколейкин^® практически не обладает побочными эффектами в отличие от Пролейкина и легко переносится пациентами. Дозы, рекомендуемые при использовании Ронколейкина^® установлены на основании клинического опыта его успешного и эффективного применения для лечения онкологических, гнойно-септических и инфекционных заболеваний и с профилактической целью.

Ронколейкин^® используют:

— с целью иммунопротекции — в дозе 250 000 МЕ (0,25 мг), что соответствует биологической активности 3 000 000 МЕ окисленной формы rIL-2;

— с целью иммунокоррекции — в дозе 500 000 МЕ (0,5 мг), что соответствует биологической активности 6 000 000 МЕ окисленной формы rIL-2;

— с целью иммунореставрации – в дозе 1 000 000 МЕ (1,0 мг), что соответствует биологической активности 12 000 000 МЕ окисленной формы rIL-2 [24, 26].

Семилетний опыт применения Ронколейкина®^® в схемах лечения сепсиса, гнойно-воспалительных заболеваний [2, 4, 8, 9, 14, 15, 27-28, 31-33, 39, 45-48, 51, 58, 64, 67-69, 73], инфекционной патологии [3, 5-6, 12-13, 17, 22-23, 30, 35-37, 43, 49, 53, 56, 61-63, 70], злокачественных опухолей [1, 7, 10, 29, 34, 40-42, 52] – свидетельство его эффективности и безопасности.