Пособие для врачей.
Новосибирск , 2005. 31 c.

РОНКОЛЕЙКИН^®
В ИММУНОПРОФИЛАКТИКЕ ПОСТХИРУРГИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ

Останин А.А., Черных Е.Р.

Пособие для врачей посвящено вопросу применения лекарственной формы рекомбинантного интерлейкина-2 человека (Ронколейкин^®, номер государственной регистрации Р N000122/01-2000; производство ООО "БИОТЕХ", Санкт-Петербург) с целью профилактики развития послеоперационных инфекционных осложнений, на примере больных со злокачественными опухолями желудочно-кишечного тракта (раком желудка и колоректальным раком). В пособии представлены данные, характеризующие основные проявления и механизмы иммунных нарушений у оперированных больных, с патогенетических позиций обосновывается необходимость использования Ронколейкина^® с целью иммунокоррекции/иммунореабилитации и профилактики возможного развития послеоперационных осложнений. Клиническая эффективность, детоксикационное и иммунокорригирующее действие Ронколейкина^® оценивается в соответствии с методологией доказательной медицины. Рекомендации предназначены для хирургов, врачей-онкологов, клинических иммунологов и студентов старших курсов медицинских вузов.

ВВЕДЕНИЕ

Послеоперационные инфекции являются основной причиной заболеваемости и смертности в хирургии, поэтому вопросам профилактики этих осложнений уделяется особое внимание. Частота развития послеоперационных инфекционных осложнений во многом зависит от "чистоты" операционных ран и хирургических вмешательств, которые по классификации NRC (США,1964) подразделяются на чистые, условно чистые, загрязненные (контаминированные) и грязные (инфицированные). При чистых операциях частота постхирургических инфекций составляет обычно 2-3%, при условно чистых — 7-10%, при контаминированных (например, аппендэктомия) — около 12-20%, тогда как при грязных операциях (например, перфорированный дивертикул) — от 20 до 70% [1, 2]. Считается, что в тех случаях, когда вероятная частота развития инфекционных осложнений превышает 5%, в комплексные программы предоперационной подготовки и/или послеоперационного ведения больных обязательно должны включаться те или иные профилактические мероприятия. Такой подход абсолютно необходим при операциях на прямой и ободочной кишках, операциях на желчных путях, гистерэктомии, а также при операциях по поводу злокачественных опухолей. Так, анализ исходов более чем 2000 операций, проведенный Lohde E. с соавт., показал [3], что постхирургические инфекции возникали в 3 раза чаще при операциях по поводу злокачественных опухолей, чем доброкачественных (74 vs 25%), почти в 2 раза чаще при уровне гемоглобина менее 120 г/л или у больных старше 69 лет (54 vs 29% и 61 vs 35% соответственно), в 2 раза чаще у больных с сопутствующими заболеваниями (79 vs 40%).
Полученные результаты представляются вполне закономерными, поскольку очевидно, что послеоперационная инфекция никогда не возникает случайно, а ее развитие зависит не только от присутствия патогенной микрофлоры, но и от состояния иммунных механизмов защиты больного. В то же время хорошо известно, что любое хирургическое вмешательство оказывает неблагоприятный эффект на систему иммунитета больного и вызывает развитие вторичного иммунодефицита. Максимальная выраженность лабораторных проявлений иммунодефицита наблюдается, как правило, на 2-3 сутки послеоперационного периода, тогда как его продолжительность может варьировать от 7 до 28 дней, что зависит, главным образом, от характера оперативного вмешательства и/или от степени исходной иммунокомпрометированности больного. Так, например, пожилой возраст пациента, тяжесть основного заболевания или сопутствующей патологии, наличие несанированных очагов хронической инфекции, являются отягощающими факторами, детерминирующими выраженность послеоперационного иммунодефицита и, как следствие, высокий риск развития инфекционных осложнений. Наиболее часто такая ситуация имеет место при выполнении оперативных вмешательств у больных онкологического профиля. Кроме того, специфика онкологических операций состоит в их продолжительности, обширности, высокой травматичности, частом нарушении регионального лимфотока вследствие иссечения лимфатических коллекторов и т.д., что создает дополнительные условия для развития и генерализации инфекции.
Многочисленные исследования четко свидетельствуют о сопряженности развития опухолевого процесса с нарушениями в иммунной системе больного, проявляющиеся изменением как количественного состава основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, так и их функциональной активности [4, 5, 6]. Не удивительно, что онкологические больные в целом, и, особенно, больные с опухолевыми заболеваниями желудочно-кишечного тракта составляют одну из наиболее вероятных групп риска послеоперационных гнойно-септических осложнений. Так, среди больных с колоректальным раком частота возникновения инфекционных осложнений в послеоперационном периоде составляет 30 — 60% [7]. Такой высокий процент осложнений обусловлен рядом дополнительных факторов, среди которых следует отметить анатомофизиологические нарушения, связанные с ростом опухоли, вскрытие кишечной трубки в процессе операции, причем содержимое кишечника нередко попадает в брюшную полость. Все это приводит к массивному инфицированию окружающих тканей.
После радикальных операций по поводу рака желудка гнойно-септические осложнения развиваются у 20 — 30% больных, при этом средний уровень летальности составляет около 42%, варьируя от 39 до 90% в случае развития послеоперационного разлитого гнойного перитонита и/или абдоминального сепсиса.
Общепринятыми профилактическими мероприятиями в хирургии являются применение сбалансированного энтерального и парентерального питания, адекватное дренирование брюшной полости, соблюдение санитарно-эпидемиологического режима, борьба с госпитальной инфекцией и т.д. В аналитическом обзоре проф. Н.В. Дмитриевой (ВОНЦ РАМН, Москва) подчеркивается, что "правильная антибиотикопрофилактика является основной частью программы сокращения постхирургических инфекций", при этом, однако, в заключении отмечается, что "несмотря на проведение антибактериальной профилактики, частота инфекционных осложнений все же продолжает оставаться достаточно высокой" [8]. Иными словами, изолированные медикаментозные воздействия, направленные против патогенной микрофлоры, имеют определенный предел своего терапевтического и санирующего действия, а для более эффективного решения проблемы, используемые профилактические схемы должны быть дополнительно ориентированы на мобилизацию "защитных сил" макроорганизма.
Очевидно, что наличие у пациентов со злокачественными опухолями выраженных изменений в иммунной системе (существующих исходно и усугубленных оперативным вмешательством, алиментарной недостаточностью, проводимой в предоперационном периоде радио- или химиотерапией) предопределяет важность разработки и внедрения в практику современных методов иммунопрофилактики послеоперационных инфекций. В настоящее время определенные перспективы в этой области связывают с активным клиническим использованием медицинских препаратов, основой которых являются цитокины. Являясь природными, функционально активными иммунорегуляторными факторами, цитокины не требуют значительного интервала времени для реализации своего модулирующего действия на иммунную систему больного. Кроме того, поскольку рецепторы к цитокинам экспрессируются клетками различных органов и тканей, то цитокины часто рассматриваются в качестве универсальных сигнальных молекул, осуществляющих связь не только внутри самой иммунной системы, но и обуславливающих её взаимодействие с другими гомеостатическими системами организма. Во многом благодаря именно этим уникальным биологическим свойствам цитокины вполне обоснованно оцениваются как лекарственные препараты XXI века.
Среди цитокинов, которые в настоящее время находятся на пути активного внедрения в хирургическую практику, в частности, для профилактики и лечения гнойно-септических заболеваний и осложнений, интерлейкин-2 (ИЛ-2) вызывает особый интерес. Так, несколькими исследовательскими группами было показано, что использование препарата колибациллярного рекомбинантного интерлейкина-2 (рИЛ-2) человека (Пролейкин^®, производства фирмы Cetus, США) у онкологических больных предупреждает развитие выраженной иммунодепрессии, индуцированной оперативным вмешательством [9, 10, 11, 12]. Пролейкин^® использовали до операции в виде подкожных инъекций по 9,0 млн МЕ, 2 раза/день, в течение 3 сут (курсовая доза 54 млн МЕ). Однако, предложенный подход характеризуется высокой стоимостью (более 1000 у.е. на курс), поскольку используются высокие дозы препарата (до 18 млн МЕ/сутки). По этой причине иммунопрофилактика с использованием Пролейкина^® сопряжена с риском развития побочных токсических реакций со стороны различных органов и систем, поскольку данный препарат получают на основе биотехнологических манипуляций с E. coli (кишечной палочкой), что не исключает наличия в его составе примеси эндотоксина.
В России рИЛ-2, разрешенный Фармкомитетом к клиническому использованию, появился в 1995 г. и получил коммерческое название Ронколейкин^®. Главным отличительным признаком отечественного препарата от импортного аналога (Пролейкина^®) является то, что активная субстанция Ронколейкина^® — рИЛ-2 — продуцируется клетками непатогенных пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат которых встроен ген интерлейкина -2 человека. Вследствие этого данный препарат не содержит примеси эндотоксина и при клиническом использовании не вызывает нежелательных побочных реакций.
За прошедшие годы накоплен определенный опыт по применению Ронколейкина^® при лечении гнойно-септических заболеваний и осложнений в хирургической практике [13, 14, 15, 16]. Имеются единичные сообщения об использовании Ронколейкина^® для профилактики послеоперационных осложнений у женщин с гнойно-воспалительными заболеваниями придатков матки [17]. В то же время в отечественной литературе отсутствуют данные о раннем применении Ронколейкина^® у оперированных больных онкологического профиля с целью профилактики послеоперационных инфекционных осложнений. В настоящее время необходимость изучения эффективности цитокинопрофилактики является актуальной научно-практической задачей, для корректного решения которой клинические исследования должны быть организованы в соответствии с методологией доказательной медицины ("evidence-based medicine").
Исходя из этого в период с 2003 по 2004 гг. были организованы и проведены рандомизированные, двойные "слепые", плацебо-контролируемые клинические испытания по оценке эффективности рИЛ-2 человека (Ронколейкина^®, номер государственной регистрации Р N000122/01-2000; производство ООО "БИОТЕХ", Санкт-Петербург) в профилактике постхирургических инфекций, на примере больных с опухолевыми заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

ФОРМУЛА МЕТОДА

Предлагаемый метод иммунопрофилактики постхирургических инфекций отличается от существующих аналогов [9, 10, 11, 12] тем, что курс иммунопрофилактики проводят в раннем послеоперационном периоде. При этом используется отечественный, фармакопейный препарат Ронколейкин^®, который в своем составе содержит дрожжевую форму рИЛ-2 человека, и вводится в дозе 0,5 млн МЕ в виде внутривенной инфузии на 2 и 5 сутки после хирургического вмешательства. Обоснованность и эффективность метода доказывается рандомизированными, двойными-слепыми, плацебо-контролируемыми испытаниями. Предложенный метод отличается высокой клинической эффективностью, отсутствием противопоказаний и побочных, токсических реакций, а также фармакоэкономической доступностью.

ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ

Иммунопрофилактика с использованием Ронколейкина^® показана в следующих случаях:
1. При хирургических операциях, при которых возможный риск развития послеоперационных инфекционных осложнений превышает 5%, т.е. при условно чистых, загрязненных и грязных операциях, а также в чистой хирургии, когда потенциальная инфекция представляет серьезную угрозу жизни и здоровью больного (протезирование клапанов сердца, суставов, артерий, аорто-коронарное шунтирование).
2. При наличии у больного следующих факторов риска:

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ

Противопоказаний к проведению иммунопрофилактики с использованием Ронколейкина^® не выявлено. Иммунопрофилактика не даст ожидаемого эффекта в случае неадекватного хирургического лечения, связанного с неустраненной причиной или недостаточной санацией/дренированием очага потенциальной инфекции.

ОПИСАНИЕ МЕТОДА (методология клинических исследований)

Оценка эффективности Ронколейкина^® в иммунопрофилактике постхирургических инфекций проводилась на примере больных онкологического профиля в дизайне рандомизированных, двойных-слепых, плацебо-контролируемых клинических испытаний (приложение 1). В исследование включались больные в возрасте от 18 до 80 лет радикально оперированные по поводу рака желудка, включая гастроэзофагеальный рак; рака толстой кишки; рака прямой кишки на любой стадии опухолевого процесса (I-IV стадия, согласно международной TNM классификации, 1989 г.). Подготовка больных к операции, а также их ведение в послеоперационном периоде осуществлялось в соответствии с общепринятыми, традиционными методиками, включая использование антибактериальных препаратов с профилактической целью (назначали цефалоспориновые препараты II поколения, например, зинацеф, в/в по 1,5 г/сут, интраоперационно и в течение первых двух дней после операции). На период проведения иммунопрофилактики Ронколейкином^® не допускалось применение других цитокин-содержащих препаратов. Основным критерием эффективности Ронколейкина^® являлось отсутствие послеоперационных инфекционных осложнений на протяжении всего периода госпитализации. Дополнительными критериями эффективности служила коррекция иммунных дисфункций и регрессия клинико-лабораторных проявлений эндотоксикоза в течение 3 дней после окончания последней инфузии Ронколейкина^®.
Курс лечения включал две внутривенные инфузии Ронколейкина^® в дозе 0,5 млн МЕ или препарата-плацебо (идентичный препарат, который в своем составе содержит только наполнитель и стабилизатор в отсутствии рИЛ-2) на вторые и пятые сутки послеоперационного периода. При проведении исследований ни лечащий врач, ни пациент не знали о варианте используемого препарата (двойное-слепое исследование). Больные, включенные в исследование, попадали в основную клиническую группу или в контрольную группу-плацебо на основе случайного распределения (т.е. в результате процедуры рандомизации). Работа по протоколу проводились бесплатно для всех больных и с их информированного согласия.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

Клинико-иммунологическая характеристика больных:
По разработанному протоколу обследовано 109 онкологических больных, радикально оперированных по поводу рака желудка (РЖ, n=59, в том числе 3 пациента с гастроэзофагеальным раком) и колоректального рака (КРР, n=50, включая 23 пациента с опухолями различных отделов толстой кишки и 27 больных раком прямой кишки). Все больные находились под наблюдением в условиях онкологического отделения МКБ N1 г. Новосибирска. Сформированная группа включала 48% (52/109) мужчин и 52% (57/109) женщин в возрасте от 19 до 80 лет (медиана 60 лет). При этом более половины больных, включенных в исследование, являлись лицами пожилого (60-69 лет, 38/109, 35%) и старческого (более 70 лет, 18/109, 16,5%) возраста. На момент госпитализации у 70/109 больных (64% случаев) было выявлено наличие сопутствующей хронической патологии со стороны различных систем (сердечно-сосудистой, дыхательной, гепато-биллиарной, почечной). Таким образом, по своему основному заболеванию, частоте выявления сопутствующей патологии, а также возрастному составу включенные в исследование больные относились к группе исходно иммунокомпрометированных пациентов.
Иммунологические исследования (см. приложение 2) в динамике проведения цитокинопрофилактики были выполнены у 56 больных (РЖ n=34, КРР n=22).
Оценка иммунного статуса, которая проводилась в раннем послеоперационном периоде до начала цитокинопрофилактики Ронколейкином^®, показала, что практически в 100% случаев у онкологических больных вне зависимости от нозологической формы рака обнаруживаются однонаправленные изменения в системе иммунитета, при этом наиболее выраженные нарушения регистрируются в Т-клеточном звене.

Примечания: данные представлены в виде M ± SE — средняя ± стандартная ошибка. LQ — UQ — нижнее и верхнее квартильное (25%) отклонение. * — p_U < 0,05 ** — p_U < 0,01, достоверность различий между группами.

Из данных таблицы 1 видно, что в целом по группе обследованных больных было выявлено достоверное снижение абсолютного количества лимфоцитов, относительного и абсолютного содержания CD3+Т-лимфоцитов, а также угнетение пролиферативного ответа Т-клеток как при стимуляции моноклональными анти-CD3-антителами по классическому пути активации (через CD3-Т-клеточный рецепторный комплекс), так и при стимуляции митогеном конканавалином А по альтернативному пути активации (через адгезивные молекулы). Дополнительно регистрировалось усиление апоптоза циркулирующих лимфоцитов крови, а также увеличение доли CD16+NK-клеток, которое имело, вероятно, компенсаторный характер, обусловленный активным опухолевым процессом.
Необходимо отметить, что у 33 из 56 обследованных больных (т.е. в 59% случаев) нарушения в Т-клеточном звене иммунитета имели комбинированный характер, т.е. проявлялись как в отношении количества, так и функциональной активности Т-лимфоцитов. При этом у больных регистрировалась выраженная абсолютная Т-лимфопения (содержание CD3+Т-лимфоцитов <0,94 х 10⁹/л) в сочетании с глубоким угнетением КонА-индуцированного пролиферативного ответа Т-клеток (<24000 имп/мин).
В целом по группе больных уровень пролиферации Т-клеток в анти-CD3-стимулированных культурах был снижен более чем в 2 раза (12810 ± 1500 vs 34730 ± 1950 имп/мин у доноров). При этом снижение пролиферативного ответа на 50% и более по сравнению со средним нормативным уровнем (т.е.<17000 имп/мин), выявлялось в 71,5% случаев (у 40 из 56 обследованных больных). Таким образом, у значительной части онкологических больных функциональная реактивность Т-клеток в ответ на стимуляцию через CD3-Т-клеточный рецепторный комплекс была резко угнетена (5950 ± 670 имп/мин, n=40), что свидетельствует о пребывании их в состоянии анергии.
По сравнению с донорами сыворотки больных отличались достоверным усилением супрессорной активности, что очевидно было обусловлено смещением баланса регуляторных факторов в сторону медиаторов с иммуносупрессорными свойствами [18]. О доминировании супрессорных/противовоспалительных медиаторов дополнительно свидетельствует значимо низкий уровень воспалительной активности сыворотки (ИВА 1,08 ± 0,04 vs 1,57 ± 0,09 расч.ед. у доноров). Следует отметить, что у 23/56 больных (в 41% случаев) суммарный биологический эффект сывороточных факторов непосредственно проявлялся в виде противовоспалительной активности, при этом сыворотки больных в среднем на 20% ингибировали продукцию реактивных радикалов кислорода лейкоцитами здоровых доноров (ИВА 0,79 ± 0,02 расч.ед., n=23).
Выявление у онкологических больных доминирующей супрессорной активности в сыворотке крови в сочетании с анергией Т-клеток представляет особый интерес, поскольку согласно появившимся в последние годы данным анергичные CD4+Т-лимфоциты или, так называемые Tr1 клетки, могут проявлять регуляторную/супрессорную активность посредством продукции ИЛ-10 [19]. Учитывая неспецифический характер супрессорной активности анергичных Т-клеток можно было предположить, что больные со сниженным aнти-CD3 ответом будут характеризоваться перекрестным снижением ответа и на другие стимулы. Действительно, сравнительный анализ пролиферативного ответа на КонА в группах больных со сниженным (<17000 имп/мин; 5950 ± 670, n=40) и относительно сохранным (>17000 имп/мин; 28060 ± 1500, n=16) анти-CD3-стимулированным ответом показал, что у пациентов с анергией Т-клеток уровень КонА-индуцированной пролиферации был значимо ниже (12620 ± 1470 vs 27580 ± 2370 имп/мин; p_U<0,001). Причем, между уровнем анти-CD3-индуцированной пролиферации и ответом на КонА выявлялась достоверная прямая корреляционная взаимосвязь (r = 0,55; p<0,0001, n=56).
Поскольку пролиферативная активность анергичных Т-клеток может быть частично или полностью восстановлена экзогенным ИЛ-2, был дополнительно исследован эффект рИЛ-2 (Ронколейкина^®) на уровень пролиферации Т-клеток больных в анти-CD3-стимулированных культурах (табл. 2). В целом по группе обследованных больных регистрировалось достоверное усиление анти-CD3 ответа в присутствии ИЛ-2 в дозе 100 ЕД/мл (ИВ_ИЛ-2 3,2 ± 0,6). Однако корригирующий эффект рИЛ-2 проявлялся в основном за счет больных с анергией Т-клеток, у которых пролиферативный ответ на анти-CD3 с 5950 ± 670 имп/мин увеличивался в присутствии рИЛ-2 до 15230 ± 1530 имп/мин (ИВ_ИЛ-2 4,1 ± 0,8). В то же время в подгруппе пациентов с относительно сохранной функциональной реактивностью Т-клеток значимого прироста в уровне пролиферации не наблюдалось (ИВ_ИЛ-2 1,07 ± 0,08).

Примечания: ** — p_t < 0,01, достоверность различий показателей анти-CD3 стимулированного пролиферативного ответа в отсутствии и в присутствии рИЛ-2.
Таким образом, в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных вне зависимости от нозологической формы рака обнаруживаются однонаправленные иммунные дисфункции, которые в большей степени затрагивают Т-клеточное звено иммунитета и проявляются в виде абсолютной лимфопении, снижения количества CD3+Т-лимфоцитов, а также угнетения их пролиферативной активности. Механизмами развития этих дисфункций являются индукция анергии и усиление апоптоза Т-лимфоцитов, которые развиваются на фоне сдвига баланса регуляторных факторов в сторону доминирования медиаторов с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью. Результаты иммунологического обследования свидетельствуют о целесообразности включения в комплекс лечебно-профилактических мероприятий, проводимый у оперированных онкологических больных, иммунотропных препаратов с целью своевременной коррекции существующих иммунных нарушений, предупреждения дальнейшего их углубления и профилактики возможного развития послеоперационных инфекционных осложнений. Учитывая преимущественное поражение Т-клеточного звена, выраженный сдвиг цитокинового баланса в строну иммуносупрессорных/противовоспалительных медиаторов, а также доказанный корригирующий эффект рИЛ-2 в отношении функциональной активности Т-клеток in vitro патогенетически обоснованным подходом в этом случае представляется использование экзогенного рИЛ-2 человека в форме отечественного фармакопейного препарата Ронколейкина^®.
Иммунокорригирующая и клиническая эффективность иммунопрофилактики По разработанному протоколу было пролечено 55 больных в основной группе и 54 пациента в группе-плацебо. Сформированные на основании критериев включения/исключения группы были сопоставимы по полу и возрасту больных, а также основным нозологическим формам и стадии рака (табл. 3).

Примечания: * — p_U< 0,05 ** — p_U< 0,01, достоверность различий по сравнению с донорами.
Тем не менее, в основной клинической группе отмечалась тенденция к более выраженному изменению баланса сывороточных регуляторных факторов, что проявлялось более низкими средними значениями соответствующих индексов (ИСА 0,78 ± 0,04 vs 0,93 + 0,06 в группе "Плацебо", р_U=0,11 и ИВА 1,02 ± 0,05 vs 1,15 ± 0,06 в группе "Плацебо", p_U=0,08). Частота развития анергии Т-клеток также была несколько выше в основной клинической группе и составляла 78,5% (22/28), тогда как в группе "Плацебо" была выявлена у 18 из 28 больных (в 64,3% случаев, рТМФ=0,18).
Ранее было показано, что высокая активность симпатического отдела вегетативной нервной системы (ВНС) сопряжена с более частым развитием послеоперационных инфекционных осложнений и худшим отдаленным прогнозом у больных раком желудка. Так, многолетние исследования, выполненные в группе 270 больных, которым были радикально оперированы по поводу рака желудка, показали, что у 154 больных с высоким уровнем симпатотонии (ИН >100 расч.ед.) послеоперационные гнойно-септические осложнения развились в 20,1% случаев (31/154). В тоже время в подгруппе больных с низким уровнем активности симпатического отдела ВНС (ИН <100 расч.ед.) частота развития послеоперационных инфекционных осложнений была достоверно ниже и составляла только 7,8% (9/116, Р_X²=0,004). При этом по другим показателям, таким как пол и возраст пациентов, стадийность опухолевого процесса, объем оперативного вмешательства, сравниваемые подгруппы больных были сопоставимы между собой.
Известно, что стимуляция -адренергических рецепторов иммунокомпетентных клеток симпатическими нейромедиаторами (норадреналин, адреналин) приводит к подавлению продукции Th1/провоспалительных цитокинов, усилению продукции иммуносупрессорных и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ТРФ-b и активации клеточной гибели через механизм апоптоза. Под влиянием факторов оперативного стресса происходит активация симпатического отдела ВНС, что приводит к увеличению уровня симпатических медиаторов, участвующих в формировании послеоперационной иммуносупрессии. Поэтому не случайно у обследованных нами больных мы обнаруживаем сдвиг баланса сывороточных факторов в сторону доминирования медиаторов с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью, функциональную ареактивность Т-клеток, повышенный апоптоз лимфоцитов и абсолютную лимфопению.
Следует при этом отметить, что в основной клинической группе доля больных с высоким уровнем симпатотонии (ИН >100 расч.ед.) была достоверно выше, чем в группе "Плацебо", и составляла соответственно 69% (38/55) и 42,6% (23/54, Р_X²=0,005). При этом относительное количество таких больных было выше также в сравниваемых подгруппах, где было выполнено иммунологическое обследование (19/28, 68% в группе "Ронколейкин^® и 9/28, 32% в группе "Плацебо", Р_X²=0,002).
Вероятно, этим можно объяснить обнаруженные тенденции в развитии более выраженных иммунных дисфункций среди пациентов основной клинической группы, у которых доминирование сывороточных факторов с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью проявлялось в большей степени, чаще регистрировалась анергия Т-клеток, несколько выше были значения апоптоза лимфоцитов в сочетании с более выраженной абсолютной лимфопенией (см. табл. 4).
Таким образом, несмотря на клиническую однородность сформированных подгрупп, результаты иммунологического обследования и анализа уровня активности симпатического отдела ВНС показывают, что вероятность развития послеоперационных инфекционных осложнений в основной клинической группе была выше по сравнению с группой "Плацебо".
Одним из критериев при оценке эффективности проводимой иммунопрофилактики являлась коррекция лабораторных проявлений эндотоксикоза и иммунодефицита. Повторное обследование больных проводили через 72 ч после окончания последней инфузии Ронколейкинаили препарата-плацебо (на 8 сутки послеоперационного периода).
У 58% (32/55) больных из основной клинической группы регистрировалось ослабление степени тяжести послеоперационного эндотоксикоза в виде нормализации температуры тела и показателей гемодинамики, достоверного снижения лейкоцитоза, СОЭ и лейкоцитарного индекса интоксикации, увеличения относительного и абсолютного количества лимфоцитов. В группе "Плацебо" детоксикационный эффект обнаруживался достоверно реже — только в 28% (15/54) случаев (Р_X²=0,001), тогда как у остальных пациентов либо вообще не отмечалось какой-либо заметной динамики (46%, 25/54), либо она была отрицательной (26%, 14/54).
Использование Ронколейкина^® в раннем послеоперационном периоде характеризовалось не только детоксикационным эффектом, но и выраженным иммунокорригирующим действием. Из данных таблицы 5 видно, что у больных из основной клинической группы очень быстро, т.е. уже через 3 дня после завершения иммунопрофилактического курса, происходила коррекция измененных показателей иммунитета. Отмечалась отчетливая тенденция нормализации субпопуляционного состава Т-лимфоцитов. При этом достоверно усиливалась пролиферативная активность Т-клеток в ответ на стимуляцию КонА и анти-CD3-мАТ. Отмечалась стабилизация показателей биологической активности сыворотки крови, т.е. прогрессии цитокинового дисбаланса не происходило (ИСА 0,78 и 0,80 расч.ед., и ИВА 1,02 и 1,06 расч.ед., соответственно до и после иммунопрофилактики). Регистрировалось достоверное снижение количества апоптотических лимфоцитов до уровня нормативных значений, что вероятно явилось одной из причин значимого увеличения относительного и абсолютного их содержания в периферической крови.
Иная картина наблюдалась в группе "Плацебо", в которой у больных, несмотря на терапию, проводимую в послеоперационном периоде в рамках традиционных и общепринятых схем, выявленные исходно иммунные дисфункции сохранялись и при повторном обследовании.

Примечания:
* — pU < 0,05 ** — pU < 0,01, достоверность различий показателей до и после проведения иммунопрофилактики Ронколейкином^®.

Из данных таблиц 6 видно, что у больных оставалось низким относительное содержание CD3+Т-лимфоцитов на фоне сохраняющейся абсолютной лимфопении, не восстанавливалась пролиферативная активность Т-клеток в ответ на стимуляцию КонА или анти-CD3-антителами. Кроме того, дополнительно регистрировалось снижение относительного количества HLA-DR+моноцитов (с 69 до 60%), а также отмечалась прогрессия цитокинового дисбаланса, что проявлялось достоверным усилением супрессорной активности сывороточных факторов (с 0,93 до 0,70 расч.ед. P<0,01), однако воспалительная активность сыворотки значимо не менялась (ИВА 1,15 и 1,26 расч.ед.). Частотный анализ показал, что дальнейшее ухудшение иммунологических показателей (снижение абсолютного количества и функциональной активности Т-клеток) при повторном обследовании было выявлено у 10 из 28 больных группы "Плацебо" (в 36% случаев), тогда как в основной клинической группе доля таких больных составила только 7% (2/28, Р_X² =0,009).

Таким образом, оценка параметров иммунитета у онкологических больных в послеоперационном периоде в динамике проведения иммунопрофилактики Ронколейкином^® в сравнении с пациентами группы «Плацебо» свидетельствует о том, что используемый препарат рИЛ-2 характеризуется отчетливым иммунокорригирующим эффектом не только в культуре in vitro, но также и в условиях in vivo при его клиническом использовании.
В соответствии с разработанным Протоколом клинических испытаний основным критерием при оценке эффективности иммунопрофилактики Ронколейкином^® являлось отсутствие постхирургической инфекции у онкологических больных на протяжении всего периода госпитализации. Развитие различных инфекционных, гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде было зафиксировано у 15 из 109 оперированных больных, что составило 13,8%. В структуре осложнений преобладали внутрибрюшные абсцессы (10/15, 66,7%). Кроме того, было отмечено развитие гнойного инфильтрата мягких тканей (1/15, 6,7%), а также некроза раны или стенок полости раны (2/15, 13,3%). У двух больных течение послеоперационного периода осложнилось развитием сепсиса (2/15, 13,3%), который у одного пациента с гастроэзофагеальным раком II степени привел к летальному исходу. Таким образом, внутрибольничная летальность в целом по группе составила 0,9% (1/109).
Анализ клинической эффективности проводимой иммунопрофилактики показал (табл. 7), что использование Ронколейкина^® в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных с целью иммунокоррекции и иммунореабилитации позволяет почти в 3 раза снизить частоту развития инфекционных осложнений с 20,4% до 7,3% (11/54 в группе-плацебо и 4/55 в основной группе, Р_X²=0,04).

При этом наиболее ярко выявленные различия в клиническом эффекте проявлялись в подгруппах больных с колоректальным раком. Так, среди этих пациентов основной клинической группы не было выявлено ни одного случая с осложненным течением послеоперационного периода, тогда как в группе "Плацебо" частота инфекционных осложнений составила 23,8% (5/21, Р_X²=0,005).
Дополнительный анализ эффективности проводимой цитокинопрофилактики в подгруппах больных с низким (ИН <100 расч.ед.) и высоким (ИН >100 рач.ед.) уровнем симпатотонии показал, что иммунопрофилактика с использованием Ронколейкина^® была эффективна также у больных высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС, которые относятся к группе повышенного риска развития послеоперационных осложнений. У данной категории больных по сравнению с группой "Плацебо" использование Ронколейкина^® приводило к снижению частота развития инфекционных осложнений с 39,0 до 5,3% (Р_X² =0,0009), в том числе при колоректальном раке с 44,4 до 0% (Р_X² =0,0004), а при раке желудка с 36,0 до 15,4% (Р_X² =0,23).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ронколейкин^® является иммунотропным, цитокин-содержащим препаратом нового поколения. Применение Ронколейкина^® в виде двух в/в инфузий по 0,5 млн МЕ в раннем послеоперационном периоде характеризуется детоксикационным и иммунокорригирующим действием и позволяет в 3 раза сократить частоту постхирургических инфекций у радикально оперированных онкологических больных. Можно полагать, что если бы проводимые нами исследования не были регламентированы "жесткими" требованиями протокола клинических испытаний, то потенциальный эффект иммунопрофилактики мог бы быть еще более значимым, поскольку представляется оправданным дополнительное однократное введение Ронколейкина^® в дооперационном периоде. Целесообразность "упреждающей" тактики была продемонстрирована при использовании импортного аналога Пролейкина^® [11, 12], и такая схема может оказаться полезной при последующем внедрении предложенного нами подхода в клиническую практику.
Клинические эффекты Ронколейкина^® связаны с его способностью стимулировать противоинфекционный иммунитет. Доказано, что ИЛ-2 протектирует развитие апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов, предотвращает развитие функциональной анергии Т-клеток, усиливает продукцию антител активированными В-лимфоцитами, нормализует нарушенный баланс про- и противовоспалительных цитокинов, опосредованно через стимуляцию продукции ИФН-Б натуральными киллерами и T-хелперами 1-го типа, восстанавливает функциональную активность клеток моноцитарно/макрофагального ряда и цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и NK-клеток. В конечном итоге, Ронколейкин^® повышает эффективность работы механизмов и неспецифической резистентности (врожденного иммунитета) и антиген-специфического иммунного ответа (приобретенного иммунитета).
Применение Ронколейкина^®, как и других цитокин-содержащих препаратов, должно проводиться под наблюдением врача. Нами не было зарегистрировано каких-либо серьезных побочных реакций при использовании Ронколейкина^® по предложенной схеме. Опыт клинического применения Ронколейкина свидетельствует о его хорошей переносимости и отсутствии токсичности. В отдельных случаях после проведения терапии Ронколейкином^® у больных может отмечаться развитие, так называемых, "цитокиновых реакций" в виде кратковременного озноба, подъема температуры тела до 38,5-39⁰С, умеренного акроцианоза. Развитие таких реакций свидетельствует о восстановлении реактивности больного, и, как правило, не требует медикаментозной коррекции.
Таким образом, Ронколейкин^® является высокоэффективным иммунотропным лекарственным препаратом, удобным в применении, не дающим побочных/токсических реакций, что позволяет использовать его не только в онкологии, но и в других областях хирургии с целью профилактики инфекционных послеоперационных осложнений, особенно, в случаях высокого риска их развития (у "иммунокомпрометированных" больных, при выполнении контаминированных или инфицированных, а также объемных и продолжительных оперативных вмешательств, и т.д.).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 2
Иммунологические исследования

Из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяют стандартными методами лейковзвесь, сыворотку, мононуклеарные клетки (МНК). МНК в концентрации 0,1х10⁶/лунку культивируют в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров IY (АВ) группы крови при 37⁰С в СО₂-инкубаторе. Для стимуляции клеток используют конканавалин А (КонA, 15 мкг/мл, Sigma) и растворимые моноклональные анти-CD3 антитела (анти-CD3-мАТ ICO-90, "Медбиоспектр" Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивают через 72 ч по включению ³Н-тимидина (1 µКю/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования.
Методом проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела ("Сорбент-сервис", Москва), определяют содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+ и СD8+Т-лимфоцитов, CD20+В-лимфоцитов, CD16+NK-клеток), а также относительное количество моноцитов, экспрессирующих HLA-DR антигены.
Методом проточной цитофлюориметрии среди свежевыделенных клеток лейковзвеси определяют также процентное содержание апоптотических лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов, которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании пропидиум иодидом.
Для исследования баланса про- и противовоспалительных цитокинов используют оценку биологической активности сыворотки крови [18]. Наличие в сыворотке супрессорной активности определяют по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК здоровых доноров (n=3) в присутствии 10% интактной сыворотки больных (опыт) в сравнении с уровнем митогенного ответа в присутствии 10% интактной сыворотки доноров (контроль). Полученные результаты выражают в виде индекса супрессорной активности (ИСА), рассчитанного по формуле: ИСА = О÷К. Значения ИСА менее 0,80 расч.ед. свидетельствуют об иммуносупрессорной активности сывороточных факторов.
Суммарную активность медиаторов, контролирующих воспалительную реакцию, оценивают по способности исследуемых образцов сыворотки стимулировать (воспалительная активность) или ингибировать (противовоспалительная активность) продукцию перекиси водорода лейкоцитами здоровых доноров. Для этого клетки лейковзвеси доноров инкубируют в течение 45 мин при 37⁰С с сывороткой больных (опыт) или здоровых доноров (контроль) в объемном соотношении 1:2 и определяют активность нейтрофилов по продукции Н₂О₂. Полученные результаты выражают в виде индекса воспалительной активности (ИВА), рассчитанного по формуле: ИВА = О÷К. Значения ИВА более 1,0 расч.ед. свидетельствуют о наличии воспалительной активности в тестируемых образцах. ИВА менее 1,0 расч.ед. свидетельствует о противовоспалительной активности сывороточных факторов.