Цитокины и воспаление. 2005. Т.4. №2. С. 54-58.
Матер. Всеросс. науч. симп.
"Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет."
Новосибирск, 2005.
Златник Е.Ю. , Голотина Л.Ю.
Научно-исследовательский онкологичsеский институт
Ростов-на-Дону

Изучение возможности применения Ронколейкина®
для LАК-терапии рака яичника

Цитокинотерапия онкологических заболеваний является одним из наиболее современных и перспективных направлений в онкоиммунологии. Несмотря на то, что идея адоптивной иммунотерапии (LAK-терапии) с применением IL-2 была высказана еще в 80-х годах ХХ века [20], ее потенциал еще далеко не исчерпан, и в настоящее время определяется прежде всего возможностью использования рекомбинантных цитокинов, их различных сочетаний, а также расширением спектра тех заболеваний, при которых такое лечение представляется целесообразным.
Ронколейкин® как препарат рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2) нашел применение для лечения различных заболеваний, в том числе и онкологических [2, 4, 5, 7]. Он используется как для внутривенного капельного введения, так и после культивирования с лимфоцитами, в ходе которого происходит генерация из естественных цитотоксических клеток LАК-клеток [1, 16]; описаны также варианты, сочетающие оба подхода [2]. При этом стимулируются не только NK-клетки, но, видимо, и макрофаги, поскольку IL-2 при действии in vitro усиливает продукцию монокинов TNF-a и IL-8, которые, в свою очередь, потенциируют эффекты IL-2 [9]. Введение аутологичных лимфоцитов после культивирования с IL-2 приводит не только к повышению их цитотоксической активности и расширению спектра клеток-мишеней, но и к снижению побочных реакций этого цитокина, которые при использовании его высоких доз бывают весьма значительными [2, 11]. Следует отметить, что первоначально применение IL-2, в том числе в виде LАК-терапии, считалось эффективным не при всех опухолях, а преимущественно при меланоме, почечно-клеточном раке, некоторых лимфопролиферативных заболеваниях [7, 18], особенно при использовании в качестве монотерапии. Однако, в последние годы появились сообщения об успешном применении данного препарата при раке легкого [4], эндометриозе [6] в качестве одного из компонентов комплексного лечения этих заболеваний.
Было проведено исследование влияния совместной инкубации Ронколейкина® с клетками лимфы грудного протока больных раком яичника на иммунобиологическое состояние лимфоцитов, а также предпринято использование LAК-терапии в комплексном лечении этих больных.

Материалы и методы

Учитывая данные литературы о дозовой и временной зависимости эффекта, известной для многих цитокинов [11], при постановке опытов были применены различные концентрации препарата и сроки инкубации. Лимфу грудного протока больных местно-распространенным и генерализованным раком яичника (350-400 мл) инкубировали в присутствии 2х106 МЕ Ронколейкина®. При этом в зависимости от ее цитоза на каждый лимфоцит приходилось 0,4-2,0 МЕ препарата на каждый лимфоцит. Проводили инкубацию лимфы с Ронколейкином® в течение 30 мин. при 37°С, а также культивирование в полной культуральной среде, содержащей среду RPMI-1640 с 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки ("Flow Lab."), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола ("Serva"), 2 мМ L-глютамина, 10 мМ буфера HEPES ("Flow Lab."), 50 мкг/мл гентамицина, в присутствии 5% СО2 в течение 24 и 48 часов. До и после культивирования изучали иммунофенотип лимфоцитов в непрямом иммунофлюоресцентном тесте с моноклональными антителами ("Сорбент") и функциональную активность лимфоцитов в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с ФГА, КонА и ЛПС [10].
С целью изучения действия препарата на естественную цитотоксичность были проведены опыты по раздельной оценке его влияния на гибель клеток-мишеней К562 (клетки эритромиелолейкоза человека) и на функцию клеток-эффекторов (NК-клеток). Для этого Ронколейкин® в концентрации 5, 50 и 5000 МЕ/мл инкубировали в течение 30 минут при 37°С:

·  с клетками-мишенями без клеток-эффекторов (контроль);

·  с клетками-мишенями, к которым затем добавляли интактные клетки-эффекторы (опыт №1);

·  с клетками-эффекторами, к которым затем добавляли интактные клетки-мишени (опыт №2).
Во всех случаях клетки трехкратно отмывали, осаждали центрифугированием и ставили цитотоксический тест (ЦТТ), включающий культивирование проб в течение 24 часов при 37°С с последующим определением процента гибели клеток-мишеней и расчетом индекса цитотоксичности (ИЦ) по формуле:

ИЦ=(О-К)/К

где О (опыт) — % погибших клеток мишеней в присутствии клеток-эффекторов,
К (контроль) — % погибших клеток-мишеней в присутствии среды.
Определение продукции IL-2 проводили в опытах с культурами клеток-продуцентов этого цитокина (Т-лимфобластной линии Jurkat). Оценивали их пролиферацию при культивировании с добавлением Ронколейкина® (опыт), среды RРMI-1640 (контроль) и альбумина (контроль). Кроме того, супернатанты опытных и контрольных 48-часовых культур Jurkat добавляли в культивируемые спленоциты мышей линии СВА и изучали их пролиферацию по результатам спонтанной 72-часовой РБТЛ.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода непрямых разностей и критерия Уилкоксона — Манна — Уитни.

Результаты и обсуждение

Результаты представлены в табл. 1 и 2. Данные табл. 1 свидетельствуют о том, что кратковременная инкубация (30 мин) с Ронколейкином® вызывает выраженное повышение экспрессии рецептора СD8+ (p<0,05). Экспрессия остальных субпопуляционных и активационных рецепторов не имела статистически достоверных отличий ни через 30 мин, ни через 24 часа после инкубации. Анализ результатов РБТЛ показал, что 30-минутная инкубация не отражается на функциональной активности лимфоцитов, тогда как 24- и 48-часовое культивирование приводит к статистически значимому усилению как спонтанной, так и митоген-индуцированной РБТЛ (табл. 1). Стимуляция достигает максимума на 1-е сутки в случае спонтанной и ЛПС-индуцированной (В-клеточной) пролиферации и на 2-е - в случае индуцированной ФГА и КонА (Т-клеточной).

Таблица 1

Влияние Ронколейкина® на некоторые иммунобиологические свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника

Показатели, %

До инкубации (n=12)

После инкубации

30 мин (n=12)

24 часа (n=10)

48 часов (n=10)

Экспрессия маркеров

СD4+

31,17±5,0

34,14±4,7

28,3±2,69

СD8+

24,2±2,42

32,9±3,6*

24,17±3,4

СD16+

17,0±2,87

22,0±2,35**

14,5±2,33**

СD25+

19,6±2,19

22,3±3,13

20,2±2,2

СD95+

17,5±1,8

18,0±2,1

18,3±1,9

HLA-DR+

23,8±1,79

26,75±3,1

20,3±2,86

РБТЛ

Спонт.

14,4±1,2

11,6±1,73**

23,8±5,6 **

18,7±1,68 *

ФГА

27,4±1,7

29,0±1,19

38,0±4,77 *

46,3±3,8 *

КонА

23,1±1,7

24,5±3,58

28,0±4,49

33,0±3,7 *

ЛПС

32,3±2,25

32,25±3,58

38,3±0,42 *

35,3±3,78

Примечание. * — статистически достоверные отличия от исходных данных (Р< 0,05);
** — статистически достоверные различия между сроками исследования.

Наиболее интересными представляются результаты оценки изменения функциональной активности NК-клеток под действием Ронколейкина® (табл. 2). Так, была выявлена цитотоксичность Ронколейкина® по отношению к культуре клеток-мишеней К562 (см. табл. 2). Кроме того, обработка лимфы препаратом стимулирует цитотоксичность естественных киллеров. Например, если результаты ЦТТ в контроле составили по проценту гибели клеток-мишеней 32,1±5,8% и по ИЦ 2,26±0,44, то постановка ЦТТ с лимфоцитами, обработанными Ронколейкином® в различных концентрациях (5, 50 и 5000 МЕ/мл), привела к повышению этих показателей, статистически достоверному при 5 и 5000 МЕ/мл (50,0±4,5 и 51,5±4,8%, соответственно); аналогичная динамика наблюдается по ИЦ (см. табл. 2). В этой таблице также представлены результаты оценки сенсибилизирующего действия Ронколейкина® на тест-культуру (см. табл. 2). Увеличение процента гибели клеток-мишеней, обработанных Ронколейкином®, в присутствии интактных лимфоцитов (с 27,8±3,09 до 33,8-41,5%) говорит о возможности такого действия, хотя различия статистически недостоверны из-за широкого разброса индивидуальных данных. По ИЦ выявлено статистически значимое возрастание цитотоксичности (с 2,0±0,29 до 3,23±0,5) при обработке клеток-мишеней минимальной из использованных концентраций Ронколейкинаы® (5 МЕ/мл), различия статистически достоверны (p<0,05).

Таблица 2

Влияние различных концентраций Ронколейкина® на функциональную активность NК-клеток (n=7)

Пробы

Контроль,
% гибели К562

Сенсибилизирующее действие на клетки- мишени

Действие на
клетки-эффекторы

% гибели К562

ИЦ

% гибели К562

ИЦ

Фон

12,0±2,52

27,8±3,09**

2,0±0,29

32,1±5,8**

2,26±0,44

Ронколейкин®
5 МЕ/мл

31,7±5,04*

41,5±7,0

3,23±0,5*

50,0±4,5* **

3,9±0,53*

Ронколейкин® 50 МЕ/мл

33,0±7,14*

40,5±6,2

3,19±0,6

44,5±3,09

3,4±0,53

Ронколейкин® 5000 МЕ/мл

37,7±4,2*

33,8±8,7

2,48±0,9

51,5±4,8* **

4,03±0,64*

Примечание. * — статистически достоверные отличия от фона (p<0,05); >
** — статистически достоверные отличия от контроля (p<0,05). >

Учитывая, что Ронколейкин® является препаратом IL-2, представлялo интерес определение его влияния на продукцию этого цитокина, поскольку известна способность многих интерлейкинов к аутокринной регуляции. Для этого проводили культивирование клеток-продуцентов IL-2 (Т-лимфобластной линии Jurkat) с Ронколейкином® в течение 24 и 48 часов. Изучение пролиферативной активности клеток Jurkat показало, что она возрастает под влиянием Ронколейкина® через 48 часов культивирования и демонстрирует тенденцию к угнетению при культивировании в присутствии альбумина (рис. 1). При этом супернатанты той же культуры, стимулированной Ронколейкином®, обладают способностью повышать пролиферацию культивируемых спленоцитов мыши, что статистически достоверно превышает стимулирующую активность супернатантов клеток Jurkat, культивированных без Ронколейкина® или с альбумином (рис.1). Полученные результаты позволяют говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейкином® вызывает усиление продукции IL-2 клетками-продуцентами, а то обстоятельство, что альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых активированными клетками Jurkat, среди которых преобладает IL-2.


Рис. 1. Влияние культивирования с Ронколейкином® и альбумином на продукцию IL-2
1 — действие на пролиферацию культуры Jurkat (% от исходного фона);2 — действие супернатантов культуры Jurkat после инкубации с Ронколейкином® и альбумином на пролиферацию спленоцитов мышей (индексы стимуляции, % от исходного фона).

На рис. 2 представлена возможная схема реализации противоопухолевого действия Ронколейкина® после культивирования с ним аутологичных лимфоцитов больных.


Рис. 2. Возможные механизмы противоопухолевого действия Ронколейкина ® после его инкубации с иммунокомпетентными клетками.

Полученные экспериментальные данные послужили основанием для использования LАК-терапии на аутологичной лимфе в клинике для лечения 8 больных раком яичника. Мы использовали в качестве источника лимфоцитов именно лимфу, поскольку она содержит большое количество клеток (до 107 в 1 мл), а дренирование грудного лимфатического протока позволяет получить ее значительный объем и дает возможность сочетать LАК-терапию с аутолимфохимиотерапией (АЛХТ), т.е., введением цитостатиков после инкубации с аутологичной лимфой [8]. Результаты клинического применения АЛХТ+LАК свидетельствуют о том, что у больных на 25-30% повышалась исходно низкая функциональная активность Т- и В- лимфоцитов. Кроме того, отмечалось снижение уровня клеток, экспрессирующих рецепторы СD8+ и СD16+, что на фоне отмеченной регрессии опухоли можно объяснить миграцией цитотоксических клеток из периферической крови в очаг, что было подтверждено морфологическим исследованием. Использование сочетания аутолимфохимиотерапии и LАК-терапии на лимфе в предоперационном периоде у больных распространенным раком яичника позволило улучшить их непосредственное состояние, уменьшить степень распространенности опухолевого процесса, количество метастазов, перевести больных из неоперабельного в операбельное состояние. Несмотря на то, что полученные данные еще малочисленны, они убедительно демонстрируют перспективу применения такого варианта использования Ронколейкина® в лечении больных раком яичника.
Итак, приведенные результаты свидетельствуют о том, что экстракорпоральная обработка лимфы больных раком яичника с помощью Ронколейкина® приводит к повышению экспрессии СD8+, увеличению спонтанной и митоген-индуцированной РБТЛ, стимуляции функциональной активности NК-клеток, а также увеличению чувствительности клеток-мишеней к действию эффекторов естественной цитотоксичности и продукции IL-2. Нами не было получено дозо-зависимого эффекта, т. е. Ронколейкин® после обработки им лимфоцитов в концентрациях 5, 50 и 5000 МЕ/мл вызывал аналогичную гибель клеток-мишеней, что позволяет проводить поиск оптимальных доз препарата в достаточно широких пределах, включая область низких доз, об эффективности которых для генерации LАК при лечении, например, рака легкого имеются сообщения в литературе [3].
Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что успешная LАК-терапия при раке яичника возможна, так как лимфоциты больных активируются в присутствии IL-2, повышая продукцию таких цитокинов как IL-2 и IFN-g [15], обладающих противоопухолевым эффектом, при этом лимфоциты трансформируются в LАК-клетки, способные лизировать даже линии опухолей яичника, экспрессирующие факторы лекарственной устойчивости, такие как pgp и mdr [17]. Важным аспектом предлагаемого метода лечения является сочетание АЛХТ с LАК-терапией с применением аутолимфы. Одной из сторон потенциирования их эффекта может быть стимуляция апоптоза опухолевых клеток. Известно, что многие цитостатики, помимо прямого действия на неопластические клетки, способны повышать экспрессию на них Fas-R [14], а важным механизмом, через которые LАК-клетки проявляют свою цитотоксичность, является индукция Fas-зависимого апоптоза клеток-мишеней [13]. Кроме того, в эксперименте показано, что LАК-клетки более интенсивно поступают в опухолевую ткань после введения цитостатиков [12]. Поэтому комбинированное применение цитостатиков и LАК-клеток способно улучшать противоопухолевый эффект, что показано на примере рака почки, легкого [4], а в рамках нашего исследования — на примере рака яичника.

Литература

1. Бережная Н.М., Ковальчук Е.В. ЛАК-феномен (фенотип клеток, механизм действия и условия его реализации) // Иммунология. 1995. №2. С. 12-16.
2. Гершанович М.Л. Применение интерлейкина-2 (Пролейкина, Алдеслейкина) в онкологической практике // Вопросы онкологии. 2003. Т. 49. №6. С. 776-782.
3. Гриневич Ю.А., Фильчаков Ф.В. Влияние адоптивной иммунотерапии на эффективность хирургического лечения больных раком легкого // Эксперим. онкол. 2000. Приложение. С. 66.
4. Кадагидзе З.Г. Цитокины и их использование в онкологии // Internat. J. on Immunorehab. 1997. №6. 47-56.
5. Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении онкологических больных // Ронколейкин в онкологической практике (Сборник статей). СПб., 2003. С. 6-18.
6. Крамарева Н.Л., Сельков С.А., Ярмолинская М.И., Павлов О.В. Изучение роли цитокинов в патогенезе эндометриоза и выборе иммунокорригирующей терапии // Мед. иммунол. 2002. Т.4. №2. С. 278-279.
7. Новиков В.И., Карандашов В.И., Сидорович И.Г. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях. М., 1999. 135 с.
8. Сидоренко Ю.С. Лимфохимиотерапия. Ростов-на-Дону: Изд. РГМУ. 2003. 320 с.
9. Тотолян А.А. Иммунологические эффекты ронколейкина in vitro и in vivo // Иммунология. 1998. №6. С. 45.
10. Фримель Х. Иммунологические методы. М., 1987. 456 с.
11. Ярилин А.А. Принципы и пути использования цитокинов в противоопухолевой терапии // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 1999. №10. С. 3-16.
12. Gold J.E., Zachary D.T., Osband M.E. Adoptive transfer of ex vivo-activated memory T-cell subsets with cyclophosphamide provides effective tumor-specific chemoimmunotherapy of advanced metastatic murine melanoma and carcinoma // Internat. J. of Cancer. 1995. 61(4): 580-6. May 16.
13. Kimura H., Iwai N., Suzuki M., Takahashi Y. Postsurgical adjuvant immunotherapy against primary non-small cell lung cancer. (Review) [19 refs] // Journal of Japan Surgical Society. 99(5):279-84, 1998 May.
14. Kuramitsu Y. Mechanisms of enhanced accumulation of transferred LAK cells into tumor sites after chemotherahy // Hokkaido J. of Medical Science. 70(3): 507-17. 1995 May.
15. Law T.M., Motzer R.J., Mazumdar M. et al. Phase III randomized trial of interleukin-2 with or without lymphokine-activated killer cells in the treatment of patients with advanced renal cell carcinoma // Cancer. 76(5):824-32, 1995 Sep 1.
16. Lee R.K., Spielman J., Zhao D.Y. et al. Perforin, Fas ligand, and tumor necrosis factor are the major cytotoxic molecules used by lymphokine-activated killer cells // Journal of Immunology. 157(5):1919-25, 1996 Sep 1.
17. Micheau O., Solary E., Hammann A.et al. Sensitization of cancer cells treated with cytotoxic drugs to Fas-mediated сytotoxicity // Journal of the National Cancer Institute. 89(11):783-9, 1997 Jun 4.
18. Nash M.A., Lenzi R., Edwards C.L. et al. Differential expression of cytokine transcripts in human epithelial ovarian carcinoma by solid tumour specimens, peritoneal exudate cells containing tumour, tumour-infiltrating lymphocyte (TIL)-derived T cell lines and established tumour cell lines // Clinical & Experimental Immunology. 112(2):172-80, 1998 May.
19. Philip P.A., Flaherty L. Treatment of malignant melanoma with interleukin-2. [Review] [64 refs] // Seminars in Oncology. 24(1 Suppl 4):S32-8, 1997 Feb.
20. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant IL-2 to patients with metastatic cancer // N. Engl. J. Med. 1985. №313. Р. 1485-1492.
21. Savas B., Cole S.P., Tsuruo T., Pross H.F. P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and lymphokine-activated killer cell susceptibility in ovarian carcinoma // Journal of Clinical Immunology. 16(6):348-57, 1996 Nov.
22. Tomita Y., Katagiri A., Saito K. et al. Аdoptive immunotherapy of patients with metastatic renal cell cancer using lymphokine-activated killer cells, interleukin-2 and cyclophosphamide: long-term results // International Journal of Urology. 5(1):16-21, 1998 Jan.

Resume

Possible application of Roncoleukin® for LAK-therapy of ovarian cancer patients.

E.Y. Zlatnik, L.Y. Golotina
Cancer Research Institute,
Rostov-on-Don, Russia.

Roncoleukin® — a recombinant IL-2 — was studied for the possibility of application by method of LAK-therapy, for which the lymph of ductus thoracicus of ovarian cancer patients receiving also autolymphochemotherapy was used as the source of lymphocytes. The immunobiologic activity of lymphocytes was studied after 30 minutes incubation with Roncoleukin® and also after cultivation during 24 and 48 hours. The increase of T-cells proliferation, autocrine stimulation of IL-2 production, growth of NK-cells cytotoxicity were observed as well as the direct cytotoxic effect on K562 target cells and sensitizing effect, i.e. the ability of Roncoleukin® to increase its` sensitivity to NK-lysis. LAK-therapy was applied in complex treatment of ovarian cancer patients. The achieved effect allows to consider the method to be a perspective one for therapy of ovarian cancer.

Согласно действующему законодательству, информация, предоставленная на сайте, предназначена для специалистов в сфере медицины и фармацевтики.

Пожалуйста, подтвердите, что Вы специалист в сфере здравоохранения.