Цитокины и воспаление.
2005. Т.4. №2. С. 54-58.
|
Таблица 1 |
|||||
Влияние Ронколейкина® на некоторые иммунобиологические свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника |
|||||
Показатели, % |
До инкубации (n=12) |
После инкубации |
|||
30 мин (n=12) |
24 часа (n=10) |
48 часов (n=10) |
|||
Экспрессия маркеров |
СD4+ |
31,17±5,0 |
34,14±4,7 |
28,3±2,69 |
— |
СD8+ |
24,2±2,42 |
32,9±3,6* |
24,17±3,4 |
— |
|
СD16+ |
17,0±2,87 |
22,0±2,35** |
14,5±2,33** |
— |
|
СD25+ |
19,6±2,19 |
22,3±3,13 |
20,2±2,2 |
— |
|
СD95+ |
17,5±1,8 |
18,0±2,1 |
18,3±1,9 |
— |
|
HLA-DR+ |
23,8±1,79 |
26,75±3,1 |
20,3±2,86 |
— |
|
РБТЛ |
Спонт. |
14,4±1,2 |
11,6±1,73** |
23,8±5,6 ** |
18,7±1,68 * |
ФГА |
27,4±1,7 |
29,0±1,19 |
38,0±4,77 * |
46,3±3,8 * |
|
КонА |
23,1±1,7 |
24,5±3,58 |
28,0±4,49 |
33,0±3,7 * |
|
ЛПС |
32,3±2,25 |
32,25±3,58 |
38,3±0,42 * |
35,3±3,78 |
Примечание. * — статистически достоверные отличия от
исходных данных (Р< 0,05);
** — статистически достоверные различия между сроками
исследования.
Наиболее интересными представляются результаты оценки изменения функциональной активности NК-клеток под действием Ронколейкина® (табл. 2). Так, была выявлена цитотоксичность Ронколейкина® по отношению к культуре клеток-мишеней К562 (см. табл. 2). Кроме того, обработка лимфы препаратом стимулирует цитотоксичность естественных киллеров. Например, если результаты ЦТТ в контроле составили по проценту гибели клеток-мишеней 32,1±5,8% и по ИЦ 2,26±0,44, то постановка ЦТТ с лимфоцитами, обработанными Ронколейкином® в различных концентрациях (5, 50 и 5000 МЕ/мл), привела к повышению этих показателей, статистически достоверному при 5 и 5000 МЕ/мл (50,0±4,5 и 51,5±4,8%, соответственно); аналогичная динамика наблюдается по ИЦ (см. табл. 2). В этой таблице также представлены результаты оценки сенсибилизирующего действия Ронколейкина® на тест-культуру (см. табл. 2). Увеличение процента гибели клеток-мишеней, обработанных Ронколейкином®, в присутствии интактных лимфоцитов (с 27,8±3,09 до 33,8-41,5%) говорит о возможности такого действия, хотя различия статистически недостоверны из-за широкого разброса индивидуальных данных. По ИЦ выявлено статистически значимое возрастание цитотоксичности (с 2,0±0,29 до 3,23±0,5) при обработке клеток-мишеней минимальной из использованных концентраций Ронколейкинаы® (5 МЕ/мл), различия статистически достоверны (p<0,05).
Таблица 2 |
|||||
Влияние различных концентраций Ронколейкина® на функциональную активность NК-клеток (n=7) |
|||||
Пробы |
Контроль, |
Сенсибилизирующее действие на клетки- мишени |
Действие на |
||
% гибели К562 |
ИЦ |
% гибели К562 |
ИЦ |
||
Фон |
12,0±2,52 |
27,8±3,09** |
2,0±0,29 |
32,1±5,8** |
2,26±0,44 |
Ронколейкин® |
31,7±5,04* |
41,5±7,0 |
3,23±0,5* |
50,0±4,5* ** |
3,9±0,53* |
Ронколейкин®
50 МЕ/мл |
33,0±7,14* |
40,5±6,2 |
3,19±0,6 |
44,5±3,09 |
3,4±0,53 |
Ронколейкин®
5000 МЕ/мл |
37,7±4,2* |
33,8±8,7 |
2,48±0,9 |
51,5±4,8* ** |
4,03±0,64* |
Примечание. * — статистически достоверные отличия от фона
(p<0,05); >
** — статистически достоверные отличия от контроля (p<0,05). >
Учитывая, что Ронколейкин® является препаратом IL-2, представлялo интерес определение его влияния на продукцию этого цитокина, поскольку известна способность многих интерлейкинов к аутокринной регуляции. Для этого проводили культивирование клеток-продуцентов IL-2 (Т-лимфобластной линии Jurkat) с Ронколейкином® в течение 24 и 48 часов. Изучение пролиферативной активности клеток Jurkat показало, что она возрастает под влиянием Ронколейкина® через 48 часов культивирования и демонстрирует тенденцию к угнетению при культивировании в присутствии альбумина (рис. 1). При этом супернатанты той же культуры, стимулированной Ронколейкином®, обладают способностью повышать пролиферацию культивируемых спленоцитов мыши, что статистически достоверно превышает стимулирующую активность супернатантов клеток Jurkat, культивированных без Ронколейкина® или с альбумином (рис.1). Полученные результаты позволяют говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейкином® вызывает усиление продукции IL-2 клетками-продуцентами, а то обстоятельство, что альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых активированными клетками Jurkat, среди которых преобладает IL-2.
Рис. 1. Влияние культивирования с Ронколейкином® и альбумином на продукцию IL-2
1 — действие на пролиферацию культуры Jurkat (% от исходного фона);2 — действие супернатантов культуры Jurkat после инкубации с Ронколейкином® и альбумином на пролиферацию спленоцитов мышей (индексы стимуляции, % от исходного фона).
На рис. 2 представлена возможная схема реализации противоопухолевого действия Ронколейкина® после культивирования с ним аутологичных лимфоцитов больных.
Рис. 2. Возможные механизмы противоопухолевого действия Ронколейкина ® после его инкубации с иммунокомпетентными клетками.
Полученные экспериментальные данные послужили основанием для использования
LАК-терапии на аутологичной лимфе в клинике для лечения 8 больных раком
яичника. Мы использовали в качестве источника лимфоцитов именно лимфу,
поскольку она содержит большое количество клеток (до 107 в 1 мл),
а дренирование грудного лимфатического протока позволяет получить ее
значительный объем и дает возможность сочетать LАК-терапию с
аутолимфохимиотерапией (АЛХТ), т.е., введением цитостатиков после инкубации с
аутологичной лимфой [8]. Результаты клинического применения АЛХТ+LАК
свидетельствуют о том, что у больных на 25-30% повышалась исходно низкая
функциональная активность Т- и В- лимфоцитов. Кроме того, отмечалось снижение
уровня клеток, экспрессирующих рецепторы СD8+ и СD16+, что на фоне отмеченной
регрессии опухоли можно объяснить миграцией цитотоксических клеток из
периферической крови в очаг, что было подтверждено морфологическим
исследованием. Использование сочетания аутолимфохимиотерапии и LАК-терапии на
лимфе в предоперационном периоде у больных распространенным раком яичника
позволило улучшить их непосредственное состояние, уменьшить степень
распространенности опухолевого процесса, количество метастазов, перевести
больных из неоперабельного в операбельное состояние. Несмотря на то, что
полученные данные еще малочисленны, они убедительно демонстрируют перспективу
применения такого варианта использования Ронколейкина® в лечении
больных раком яичника.
Итак, приведенные результаты свидетельствуют о том, что экстракорпоральная обработка
лимфы больных раком яичника с помощью Ронколейкина® приводит к
повышению экспрессии СD8+, увеличению спонтанной и митоген-индуцированной
РБТЛ, стимуляции функциональной активности NК-клеток, а также увеличению
чувствительности клеток-мишеней к действию эффекторов естественной
цитотоксичности и продукции IL-2. Нами не было получено дозо-зависимого
эффекта, т. е. Ронколейкин® после обработки им лимфоцитов в
концентрациях 5, 50 и 5000 МЕ/мл вызывал аналогичную гибель клеток-мишеней,
что позволяет проводить поиск оптимальных доз препарата в достаточно широких
пределах, включая область низких доз, об эффективности которых для генерации
LАК при лечении, например, рака легкого имеются сообщения в литературе [3].
Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что успешная
LАК-терапия при раке яичника возможна, так как лимфоциты больных активируются
в присутствии IL-2, повышая продукцию таких цитокинов как IL-2 и IFN-g [15], обладающих противоопухолевым
эффектом, при этом лимфоциты трансформируются в LАК-клетки, способные
лизировать даже линии опухолей яичника, экспрессирующие факторы лекарственной
устойчивости, такие как pgp и mdr [17]. Важным аспектом предлагаемого метода
лечения является сочетание АЛХТ с LАК-терапией с применением аутолимфы. Одной
из сторон потенциирования их эффекта может быть стимуляция апоптоза
опухолевых клеток. Известно, что многие цитостатики, помимо прямого действия
на неопластические клетки, способны повышать экспрессию на них Fas-R [14], а
важным механизмом, через которые LАК-клетки проявляют свою цитотоксичность,
является индукция Fas-зависимого апоптоза клеток-мишеней [13]. Кроме того, в
эксперименте показано, что LАК-клетки более интенсивно поступают в опухолевую
ткань после введения цитостатиков [12]. Поэтому комбинированное применение
цитостатиков и LАК-клеток способно улучшать противоопухолевый эффект, что
показано на примере рака почки, легкого [4], а в рамках нашего исследования —
на примере рака яичника.
Литература
1. Бережная Н.М., Ковальчук Е.В. ЛАК-феномен (фенотип
клеток, механизм действия и условия его реализации) // Иммунология. 1995. №2.
С. 12-16.
2. Гершанович М.Л. Применение интерлейкина-2 (Пролейкина, Алдеслейкина) в
онкологической практике // Вопросы онкологии. 2003. Т. 49. №6. С. 776-782.
3. Гриневич Ю.А., Фильчаков Ф.В. Влияние адоптивной иммунотерапии на
эффективность хирургического лечения больных раком легкого // Эксперим.
онкол. 2000. Приложение. С. 66.
4. Кадагидзе З.Г. Цитокины и их использование в онкологии // Internat. J. on
Immunorehab. 1997. №6. 47-56.
5.
Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М. Иммунотерапия рекомбинантными
цитокинами в лечении онкологических больных // Ронколейкин в онкологической
практике (Сборник статей). СПб., 2003. С. 6-18.
6. Крамарева Н.Л., Сельков С.А., Ярмолинская М.И., Павлов О.В. Изучение роли
цитокинов в патогенезе эндометриоза и выборе иммунокорригирующей терапии //
Мед. иммунол. 2002. Т.4. №2. С. 278-279.
7. Новиков В.И., Карандашов В.И., Сидорович И.Г. Иммунотерапия при
злокачественных новообразованиях. М., 1999. 135 с.
8. Сидоренко Ю.С. Лимфохимиотерапия. Ростов-на-Дону: Изд. РГМУ. 2003. 320 с.
9. Тотолян А.А. Иммунологические эффекты ронколейкина in vitro и in vivo //
Иммунология. 1998. №6. С. 45.
10. Фримель Х. Иммунологические методы. М., 1987. 456 с.
11. Ярилин А.А. Принципы и пути использования цитокинов в противоопухолевой
терапии // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 1999. №10. С. 3-16.
12. Gold J.E., Zachary D.T., Osband M.E. Adoptive transfer of ex
vivo-activated memory T-cell subsets with cyclophosphamide provides effective
tumor-specific chemoimmunotherapy of advanced metastatic murine melanoma and
carcinoma // Internat. J. of Cancer. 1995. 61(4): 580-6. May 16.
13. Kimura H., Iwai N., Suzuki M., Takahashi Y. Postsurgical adjuvant immunotherapy
against primary non-small cell lung cancer. (Review) [19 refs] // Journal of
Japan Surgical Society. 99(5):279-84, 1998 May.
14. Kuramitsu Y. Mechanisms of enhanced accumulation of transferred LAK cells
into tumor sites after chemotherahy // Hokkaido J. of Medical Science. 70(3):
507-17. 1995 May.
15. Law T.M., Motzer R.J., Mazumdar M. et al. Phase III randomized trial of
interleukin-2 with or without lymphokine-activated killer cells in the
treatment of patients with advanced renal cell carcinoma // Cancer.
76(5):824-32, 1995 Sep 1.
16. Lee R.K., Spielman J., Zhao D.Y. et al.
Perforin, Fas ligand, and tumor necrosis factor are the major cytotoxic
molecules used by lymphokine-activated killer cells // Journal of Immunology.
157(5):1919-25, 1996 Sep 1.
17. Micheau O., Solary E., Hammann A.et al. Sensitization of cancer cells
treated with cytotoxic drugs to Fas-mediated сytotoxicity // Journal of the
National Cancer Institute. 89(11):783-9, 1997 Jun 4.
18. Nash M.A., Lenzi R., Edwards C.L. et al. Differential expression of
cytokine transcripts in human epithelial ovarian carcinoma by solid tumour
specimens, peritoneal exudate cells containing tumour, tumour-infiltrating
lymphocyte (TIL)-derived T cell lines and established tumour cell lines // Clinical
& Experimental Immunology. 112(2):172-80, 1998 May.
19. Philip P.A., Flaherty L. Treatment of malignant melanoma with
interleukin-2. [Review] [64 refs] // Seminars in Oncology. 24(1 Suppl
4):S32-8, 1997 Feb.
20. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. Observations on the systemic
administration of autologous lymphokine-activated killer cells and
recombinant IL-2 to patients with metastatic cancer // N. Engl. J. Med. 1985.
№313. Р. 1485-1492.
21. Savas B., Cole S.P., Tsuruo T., Pross H.F. P-glycoprotein-mediated
multidrug resistance and lymphokine-activated killer cell susceptibility in
ovarian carcinoma // Journal of Clinical Immunology. 16(6):348-57, 1996 Nov.
22. Tomita Y., Katagiri A., Saito K. et al. Аdoptive immunotherapy of
patients with metastatic renal cell cancer using lymphokine-activated killer
cells, interleukin-2 and cyclophosphamide: long-term results // International
Journal of Urology. 5(1):16-21, 1998 Jan.
Resume
Possible application of Roncoleukin® for LAK-therapy of ovarian cancer patients.
E.Y. Zlatnik, L.Y. Golotina
Cancer Research
Institute,
Rostov-on-Don, Russia.
Roncoleukin® — a recombinant IL-2 — was
studied for the possibility of application by method of LAK-therapy, for
which the lymph of ductus thoracicus of ovarian cancer patients receiving
also autolymphochemotherapy was used as the source of lymphocytes. The
immunobiologic activity of lymphocytes was studied after 30 minutes
incubation with Roncoleukin® and also after cultivation during 24 and 48
hours. The increase of T-cells proliferation, autocrine stimulation of IL-2
production, growth of NK-cells cytotoxicity were observed as well as the
direct cytotoxic effect on K562 target cells and sensitizing effect, i.e. the
ability of Roncoleukin® to increase its` sensitivity to NK-lysis. LAK-therapy
was applied in complex treatment of ovarian cancer patients. The achieved
effect allows to consider the method to be a perspective one for therapy of
ovarian cancer.