Вопросы онкологии. 2003. том 49. №2. С. 170-175. Останин А.А., Центнер М. И., Хонина Н.А, Леплина О. Ю.,Шевела Е.Я., Никонов С.Д., Ступак В.В., Черных Е.Р. НИИ клинической иммунологии СО РАМН, НИИ травматологии и ортопедии Минздрава РФ, Новосибирск Антигенспецифическая иммунотерапия в комплексном лечении больных Целью работы явилось изучение иммунитета в динамике проведения комплексного лечения, а также оценка эффективности экстракорпоральной антигенспецифической иммунотерапии (ЭАИТ) у больных с внутримозговыми опухолями. ЭАИТ проводили в режиме » пилотных » исследований в соответствии с ранее разработанным патентом. Исходно у больных регистрировалось снижение количества HLA-DR+ моноцитов и угнетение их пролиферативной активности in vitro. Проведение в раннем послеоперационном периоде индукторной фазы ЭАИТ предупреждало углубление дисфункции иммунной системы под влиянием факторов оперативного вмешательства. За период 1998-2000 гг. ЭАИТ была выполнена у 33 больных с анапластическими астроцитомами (АА, n=20) и глиобластомами (ГБ, n=13). Средняя курсовая доза вводимых клеток составила 2,43±0,18х109/больного. Лечение по предложенному протоколу было хорошо переносимым. В настоящее время собрана информация о 31 больном, из которых 22 человека живы и находятся под наблюдением, и 9 человек (4 с ГБ и 5 с АА) умерли (летальность 29%). Средняя продолжительность безрецидивного периода у живых больных составила 14±2 мес. (n=22), при этом стойкая ремиссия длительностью 1-2 года зарегистрирована в 37,5% (3/8) и 64% (9/34) случаев у больных ГБ и АА соответственно. Через год после окончания ЭАИТ у больных, как правило, регистрировалось полное восстановление показателей иммунитета. Таким образом, использование комплексного подхода (оперативное лечение в сочетании с ЭАИТ) позволяет повысить эффективность лечения больных с внутримозговыми опухолями. Ключевые слова: иммунитет, антигенспецифическая иммунотерапия, цитокины, злокачественные глиомы человека. В последние годы в России, как и в других странах мира, прослеживается тенденция к увеличению заболеваемости опухолями центральной нервной системы [8, 9]. По данным различных авторов, среди первичных опухолей головного мозга глиомы составляют в среднем 40-55%, причем наиболее часто (до 60% случаев) встречаются анапластические астроцитомы (АА) и глиобластомы (ГБ). Эта группа внутримозговых опухолей объединяется как общим происхождением из астроцитарной глии, так и рядом специфических особенностей: отсутствием четких границ с мозгом, частым рецидивированием, низкой чувствительностью к химио- и радиотерапии. Несмотря на то, что в лечении злокачественных опухолей мозга часто используется комплексный подход, включающий в себя оперативное вмешательство и химиолучевую терапию, средняя продолжительность жизни большинства больных с низкодифференцированными глиомами не превышает 12 мес., а показатели 5-летней выживаемости варьируют в диапазоне от 3,5 до 12% [2, З]. В настоящее время перспективы лечения злокачественных опухолей головного мозга во многом связывают с новейшими биотехнологиями, в частности, с разработкой и внедрением в практику методов экстракорпоральной иммунотерапии. С целью усиления противоопухолевого иммунитета используют неспецифический и антигенспецифический варианты проведения иммунотерапии. В рамках первого подхода при лечении опухолей различной локализации применяют, как правило, цитокины (интерфероны, интерлейкин-2), полиадъюванты, а также лимфокин-активированные киллерные (ЛАК) клетки [6, 10, 11]. Примером второго подхода является использование внутривенных инфузий аутологичных лимфоцитов, активированных ех vivo опухолевыми антигенами и смесью нативных цитокинов [1, 5]. Однако в силу наличия гематоэнцефалического барьера внутривенное введение аутологичных антигенспецифических лимфоцитов или ЛАК-клеток часто оказывается недостаточно эффективным в отношении злокачественных опухолей так называемых «забарьерных тканей», в частности, внутримозговой локализации. Кроме того, достоверное увеличение продолжительности безрецидивного периода при проведении неспецифической и/или антигенспецифической иммунотерапии регистрируется у больных при условии максимальной хирургической резекции опухоли. Важно отметить, что возможность тотального удаления глиом мозга ограничена как визуально определяемыми во время операции границами опухоли и физиологической значимостью пораженных зон мозга (даже с использованием увеличительной оптики), так и инфильтрацией опухолевыми клетками перифокальной зоны, которая достигает 2 см [2]. Исходя из выше изложенного, наши исследования были направлены на разработку нового метода экстракорпоральной антигенспецифической иммунотерапии (ЭАИТ), включение которого в программу комплексного лечения злокачественных глиом головного мозга позволило бы повысить уровень качества жизни и увеличить продолжительность безрецидивного периода у больных с внутримозговыми опухолями. Материал и методика За период 1998-2000 гг. клинико-иммунологические исследования выполнены в группе 45 больных со злокачественными опухолями головного мозга. Из данных, представленных в табл. 1, видно, что глиомы (астроцитомы и глиобластомы) головного мозга в 2-4 раза чаще развивались у мужчин. Средний возраст больных составил 41±2 года, при этом примерно с равной частотой встречались пациенты моложе и старше 40 лет. В целом по группе подавляющее большинство случаев (82%) было представлено первичными опухолями мозга, и только у 8 больных обследование и лечение проводились по поводу возврата заболевания. В наших наблюдениях анапластическая астроцитома несколько чаще регистрировалась справа, тогда как глиобластома характеризовалась тенденцией к левополушарной локализации. Как правило, опухолевый процесс затрагивал белое вещество теменной и височной долей (более 50% всех наблюдений), или располагался на стыке 2-3 областей (29% случаев). Таблица 1 Характеристика больных со злокачественными опухолями головного мозга
Всем больным было проведено оперативное лечение. После костно-пластической трепанации черепа в проекции опухоли под увеличением в 4,4 раза патологический опухолевый субстрат удаляли с использованием микрохирургической техники и ультразвукового аспиратора. Затем осуществляли тщательный гемостаз и производили пластику твердой мозговой оболочки гомотрансплантатом. В 33 из 45 случаев (73% больных) через контраппертуру (в 1 см от основного разреза) в ложе удаленной опухоли устанавливался хлорвиниловый катетер, который фиксировался лигатурами. У подавляющего (91%) числа больных была выявлена субтотальная резекция опухоли, которая осуществлялась в пределах визуально определяемых границ. В целом по группе средний объем удаленной опухоли составил 163±19 см3. У 33 пациентов комплексное лечение включало экстракорпоральную иммунотерапию, которую проводили в режиме пилотных исследований в соответствии с ранее разработанным патентом [4]. Кратко, до начала ЭАИТ проходила подготовительная стадия получения суспензии аутологичных опухолевых клеток, которые после соответствующей инактивации и консервации далее использовали в качестве источника опухолевых антигенов. На 3-4-е сутки послеоперационного периода с целью ранней иммунокоррекции проводили первую, индукторную фазу ЭАИТ в виде внутривенных инфузий перфузата ксеноселезенки (ПКС) — комплексного препарата, содержащего смесь нативных цитокинов [7]. Основной этап ЭАИТ заключался в последовательном проведении 6 процедур выделения из крови пациента мононуклеарных клеток (МНК) и их культивирования в течение 48 ч с рекомбинантным интерлейкином-2 (рИЛ-2, «Ронколейкинâ «, производства 000 «Биотех», Санкт-Петербург) и аутологичными опухолевыми антигенами. Полученные клетки вводили в ложе удаленной опухоли в сочетании с Ронколейкиномâ в оптимальной дозе. Средняя курсовая доза введенных клеток составила 2,43±0,18×109 /больного. Завершали ЭАИТ 10-15 подкожными инъекциями смеси аутологичных цитокинов, полученных при культивировании лимфоцитов больного с опухолевым антигеном в присутствии рИЛ-2. Таблица 2 Шкала оценки уровня качества жизни
Комплексное лечение дополнялось последующим проведением дистанционной лучевой терапии в суммарной дозе 50-60 Гр. В процессе лечения оценивалось общее состояние больных на основании результатов клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования, включая ЯМР томографию, электроэнцефалографию головного мозга, оценку зрительных вызванных потенциалов. До операции и перед выпиской определяется неврологический статус пациента, при этом особое внимание отводилось оценке уровня качества жизни по шкале Карновского в нашей модификации (табл. 2). При исследовании иммунного статуса больных методом проточной цитофлюориметрии (FACS, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела (ТОО «Сорбент», Москва) определяли содержание различных субпопуляций клеток (CD3+, CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, CD20+ B-лимфоцитов, CD16+ NK-клеток), а также относительное количество лимфоцитов и моноцитов, экспрессирующих HLA-DR антигены. Рассчитывали величину иммунорегуляторного CD4/CD8 индекса. В культурах МНК оценивали интенсивность спонтанной и митоген-индуцированной (конканавалин А, КонА 15 мкг/мл) пролиферации (по включению Н3-тимидина). Исследования иммунитета осуществляли до и после операции, а также после окончания курса ЭАИТ. Контрольную группу при изучении иммунного статуса больных составили 40 здоровых доноров крови в возрасте от 20 до 50 лет. Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической н непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 5.0» Результаты и обсуждение Исследования иммунного статуса больных со злокачественными глиомами, выполненные до проведения оперативного вмешательства, показали, что развитие опухолевого процесса в головном мозге сопряжено с изменениями количественных и функциональных показателей иммунитета (табл. 3). Так, по сравнению со здоровыми донорами у больных регистрировалось достоверное снижение относительного содержания HLA-DR+ моноцитов и выраженное угнетение спонтанной и митоген-индуцированной пролиферативной активности МНК в условиях in vitro. Статистически значимых различий в исходном состоянии иммунитета больных в зависимости от гистологических особенностей опухоли (глиобластомы в сравнении с астроцитомами) выявлено не было. Анализ динамики иммунологических параметров показал, что проведение в раннем послеоперационном периоде индукторной фазы ЭАИТ с использованием нативных цитокинов (ПКС) позволило предупредить дальнейшее углубление дисфункции иммунной системы, индуцированное факторами оперативного вмешательства (травма, стресс, наркоз, кровопотеря). Перед началом курса ЭАИТ у больных регистрировалось лишь умеренное снижение КонА-индуцированного пролиферативного ответа (с 36380±4190 до 25770±3890 имп/мин pu<0,05), тогда как все остальные параметры иммунного статуса не отличались от дооперационного уровня. Таблица 3 Сравнительная оценка показателей иммунного статуса в группах
здоровых доноров
Примечания: *pu <0,05; ** pu <0,01 — достоверность различий показателей по сравнению с донорами (U — непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Индекс влияния КонА (ИВКонА) рассчитывали как отношение интенсивности КонА-индуцированного пролиферативного ответа клеток к уровню спонтанной пролиферации. Экстракорпоральная антигенспецифическая терапия была проведена у 20 больных с анапластическими астроцитомами и 13 больных с глиобластомами. Исходное состояние пациентов, оцененное по шкале Карновского, в анализируемых группах не различалось (56±4 и 55±5 баллов) так же, как и средняя курсовая доза клеток, полученных больными при проведении ЭАИТ (2,42±0,23 и 2,43±0,29х109/больного). Курсовое лечение по предложенному протоколу было хорошо переносимым и не сопровождалось развитием каких-либо серьезных побочных или токсических реакций. Напротив, многие больные отмечали субъективное улучшение, а проведенная по окончании ЭАИТ оценка качества жизни показала статистически значимое увеличение среднего уровня до 83 и 76 баллов у больных с глиобластомами и астроцитомами, соответственно. В настоящее время точные данные катамнеза собраны о 31 из 33 больных, прошедших курс ЭАИТ. Из них на начало февраля 2001 г. 22 человека живы (71%) и 9 человек умерли (29%). В группе больных с глиобластомами летальность составила 33% (4/12). Из 19 больных с астроцитомами умерли 5 пациентов (летальность 26%), у 3 из которых ЭАИТ проводилась по поводу прогрессирования заболевания. Среди умерших больных продолжительность жизни после завершения комплексного лечения, как правило, не превышала 1 года, составляя в среднем 8±2 мес. Средняя продолжительность безрецидивного периода у живых больных злокачественными глиомами составила 14±2 мес (n=22). Отметим, что стойкая ремиссия длительностью от 1 года до 2 лет зарегистрирована в 37,5% (3/8) и 64% (9/14) случаев у больных ГБ и АА соответственно. Проведенный сравнительный анализ умерших больных (n=9) и пациентов с продолжительностью ремиссии более 12 мес. (n=12) показал (табл. 4), что у пациентов первой группы был достоверно ниже исходный уровень качества жизни, а также почти в 1,7 раза больше средний объем удаленной опухолевой массы. Несмотря на то, что средний возраст больных в анализируемых группах значимо не различался, пациенты старше 60 лет были только в группе умерших больных (Pтмф=0,021). Каких-либо статистически значимых различий по полу, частоте рецидивирования, курсовой дозе клеток, показателям иммунного статуса до/после операции, а также после окончания ЭАИТ в этих сравниваемых группах выявлено не было. Таблица 4 Сравнительная характеристика умерших больных со злокачественными
глиомами
Следует отметить, что в целом по группе пациентов со злокачественными глиомами, прошедших курс ЭАИТ (n=33), состояние иммунитета больных после завершения комплексного лечения оставалось стабильным, при этом отмечалась умеренно выраженная тенденция к усилению пролиферативной активности МНК. Полная нормализация измененных показателей иммунного статуса (относительного количества HLA-DR+ моноцитов, митогенной реактивности клеток) происходит у больных, по-видимому, в более поздние сроки. Данное предположение проиллюстрировано на рисунке, где показана динамика восстановления уровня КонА-индуцированного пролиферативного ответа МНК у трех пациентов в ближайшем и отдаленном периоде после проведения курса экстракорпоральной антигенспецифической иммунотерапии. Таким образом, установлено, что развитие опухолевого процесса в головном мозге сопряжено со снижением количественных (относительного содержания HLA-DR+ моноцитов) и функциональных (пролиферативной активности клеток) параметров иммунитета у больных со злокачественными глиомами. В результате проведения курса ЭАИТ не регистрировалось дальнейшего снижения иммунитета под влиянием факторов оперативного вмешательства. Напротив, либо в ближайшем (у части больных), либо в отдаленном послеоперационном периоде происходило постепенное восстановление измененных иммунологических показателей. По завершении программы комплексного лечения отмечалось статистически значимое повышение уровня качества жизни оперированных больных. За трехлетний период наблюдения летальность больных с глиобластомами и анапластическими астроцитомами составила 33 и 26% соответственно. Средняя продолжительность безрецидивного периода среди пациентов, находящихся под наблюдением, составила 14±2 мес. При этом стойкая ремиссия длительностью свыше 24 мес. зарегистрирована у 5 из 12 больных (41,7%), у которых после окончания ЭАИТ прошло более одного года. Динамика восстановления пролиферативной активности МНК По оси ординат — интенсивность КонА-индуцированного пролиферативного
ответа (имп./мин х 10 -3). ЛИТЕРАТУРА
ANTIGEN-SPECIFIC IMMUNOTHERAPYBR AS A COMPONENT OF COMPLEX TREATMENT Osianin A.A., Centner M.I., Khonina N.A., Leplina O.Yu., Shevela Ye.Yu., Nikonov S.D., Stupak V.V. Ye.R.Chernykh Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Medical Sciences. Siberian Branch; The purpose of the present research was to study immunity in the course of complex treatment for malignant gliomas of the brain and to evaluate extracorporeal antigen-specific immunotherapy (EASIT) a pilot procedure which was carried out according to an approved protocol. Initially lowered HLA-DR+ monocyte count and in vitro inhibition of proliferative activity were reported in all patients. Inductive EASIT started in early postoperative period aborted immune disturbances caused by surgery. In 1998-2000, the procedure was performed in 33 patients with anaplastic astrocytoma (AA) (20) and glioblastoma (GB) (13). Mean dose of cell infusion was 2,43±0,18 x 109 /patient and was well tolerated. There are 22 survivors and 9 patients died (GB — 4 and AA — 5; overall mortality — 29 %). Mean relapse-free survival was 14,2 mo (22); stable remission during 12-18 mo. — 37,5 % (3/8) (GB) and 64 % (9/14) (AA). Complete rehabilitation of immunity was generally reported 12 mo. after the course of EASIT. Hence, complex treatment (surgery + EASIT) enhanced its efficacy in the management of brain tumors. |